Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamahusay na mga resulta, inirerekomenda namin na gumamit ka ng mas bagong bersyon ng iyong browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site nang walang pag-istilo o JavaScript.
Ang pagtuklas at kapaki-pakinabang na paggamit ng mga likas na produkto ay maaaring makatulong sa pagpapabuti ng buhay ng tao.Ang mga kemikal na pumipigil sa paglago ng halaman ay malawakang ginagamit bilang mga herbicide para makontrol ang mga damo.Dahil sa pangangailangang gumamit ng iba't ibang uri ng herbicide, kailangan na tukuyin ang mga compound na may mga bagong mekanismo ng pagkilos.Sa pag-aaral na ito, natuklasan namin ang isang nobelang N -alkoxypyrrole compound, coumamonamide, mula sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 at itinatag ang kumpletong proseso ng synthesis.Sa pamamagitan ng biological activity assays, natuklasan namin na ang urs-monoamic acid ay isang synthetic intermediate ng urs-monoamide at isang potensyal nainhibitor sa paglago ng halaman.Bilang karagdagan, nakabuo kami ng iba't ibang urbenonic acid derivatives, kabilang ang urbenyloxy derivative (UDA), na may mataas na herbicidal activity nang hindi negatibong nakakaapekto sa paglaki ng mga HeLa cells.Nalaman din namin na ang urmotonic acid derivatives ay nakakagambala sa mga microtubule ng halaman;bilang karagdagan, ang KAND ay nakakaapekto sa mga filament ng actin at nagdudulot ng pagkamatay ng cell;Ang mga multifaceted effect na ito ay naiiba sa mga kilalang microtubule inhibitors at nagmumungkahi ng bagong mekanismo ng pagkilos para sa ursonic acid, na kumakatawan sa isang mahalagang kalamangan sa pagbuo ng mga bagong herbicide.
Ang pagtuklas at praktikal na aplikasyon ng mga kapaki-pakinabang na likas na produkto at ang kanilang mga hinango ay isang paraan ng pagpapabuti ng kalidad ng buhay ng tao.Ang mga pangalawang metabolite na ginawa ng mga mikroorganismo, halaman at insekto ay humantong sa malalaking pag-unlad sa medisina at agrikultura.Maraming antibiotics at anti-leukemia na gamot ang nabuo mula sa mga natural na produkto.Bilang karagdagan, ang iba't ibang uri ngmga pestisidyo, ang mga fungicide at herbicide ay kinukuha mula sa mga likas na produktong ito para gamitin sa agrikultura.Sa partikular, ang mga weed control herbicide ay mahalagang kasangkapan para sa pagtaas ng mga ani ng pananim sa modernong agrikultura, at ang iba't ibang uri ng mga compound ay ginagamit na sa komersyo.Ang ilang mga proseso ng cellular sa mga halaman, tulad ng photosynthesis, metabolismo ng amino acid, cell wall synthesis, regulasyon ng mitosis, phytohormone signaling, o synthesis ng protina, ay itinuturing na tipikal na mga target ng herbicide.Ang mga compound na pumipigil sa paggana ng microtubule ay isang karaniwang klase ng mga herbicide na nakakaapekto sa paglago ng halaman sa pamamagitan ng pag-apekto sa mitotic regulation2.
Ang mga microtubule ay mga bahagi ng cytoskeleton at malawak na nakaimbak sa mga eukaryotic na selula.Ang tubulin heterodimer ay binubuo ng α-tubulin at β-tubulin na bumubuo ng mga linear na microtubule na protofilament, na may 13 protofilament na bumubuo ng isang cylindrical na istraktura.Ang mga microtubule ay gumaganap ng maraming papel sa mga selula ng halaman, kabilang ang pagtukoy ng hugis ng cell, paghahati ng cell, at intracellular transport3,4.Ang mga cell ng halaman ay naglalaman ng mga microtubule sa ilalim ng interphase plasma membrane, at ang mga tinatawag na cortical microtubules ay naisip na kontrolin ang organisasyon ng cellulose microfibrils sa pamamagitan ng regulasyon ng cellulose synthase complexes4,5.Ang mga cortical microtubule ng root epidermal cells, na naroroon sa zone ng mabilis na pagpahaba ng dulo ng ugat, ay matatagpuan sa gilid, at ang cellulose microfibers ay sumusunod sa mga microtubule na ito at nililimitahan ang direksyon ng pagpapalawak ng cell, at sa gayon ay nagpo-promote ng anisotropic cell elongation.Samakatuwid, ang pag-andar ng microtubule ay malapit na nauugnay sa morpolohiya ng halaman.Ang mga pagpapalit ng amino acid sa mga gene na nag-encode ng tubulin ay nagdudulot ng skew ng cortical microtubule arrays at kaliwa o kanang panig na paglaki sa Arabidopsis 6,7.Katulad nito, ang mga mutasyon sa mga protina na nauugnay sa microtubule na kumokontrol sa microtubule dynamics ay maaari ring humantong sa distorted root growth8,9,10,11,12,13.Bilang karagdagan, ang paggamot na may microtubule-disrupting herbicides gaya ng disopyramide, na kilala rin bilang pretilachlor, ay nagdudulot din ng pahilig na paglaki ng ugat sa kaliwang bahagi14.Ang mga data na ito ay nagpapahiwatig na ang tumpak na regulasyon ng microtubule function ay kritikal para sa pagtukoy ng direksyon ng paglago ng halaman.
Natuklasan ang iba't ibang uri ng microtubule inhibitors, at ang mga gamot na ito ay nakagawa ng makabuluhang kontribusyon sa pananaliksik sa cytoskeletal, pati na rin sa agrikultura at gamot2.Sa partikular, ang oryzalin, dinitroaniline compounds, disopyramide, benzamide-related compounds, at ang kanilang mga analogue ay maaaring humadlang sa paggana ng microtubule at sa gayon ay pagbawalan ang paglago ng halaman.Samakatuwid, ang mga ito ay malawakang ginagamit bilang mga herbicide.Gayunpaman, dahil ang microtubule ay isang mahalagang bahagi ng mga selula ng halaman at hayop, karamihan sa mga microtubule inhibitor ay cytotoxic sa parehong uri ng cell.Samakatuwid, sa kabila ng kanilang kinikilalang utility bilang mga herbicide, isang limitadong bilang ng mga antimicrotubule agent ang ginagamit para sa mga praktikal na layunin.
Ang Streptomyces ay isang genus ng pamilyang Streptomyces, na kinabibilangan ng aerobic, gram-positive, filamentous bacteria at malawak na kilala sa kakayahang gumawa ng malawak na hanay ng mga pangalawang metabolite.Samakatuwid, ito ay itinuturing na isa sa pinakamahalagang mapagkukunan ng mga bagong biologically active na natural na produkto.Sa kasalukuyang pag-aaral, natuklasan namin ang isang bagong compound na tinatawag na coumamonamide, na nahiwalay sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 at S. werraensis ISP 5486. Gamit ang spectral analysis at full spectral analysis, ang istraktura ng coumamonamide ay nailalarawan at ang natatanging N-alkoxypyrrole skeleton nito ay determinado.synthesis.Ang Ursmonic acid, isang sintetikong intermediate ng ursmonoamide at mga derivatives nito, ay natagpuan na pumipigil sa paglaki at pagtubo ng sikat na modelong halaman na Arabidopsis thaliana.Sa isang structure-activity relationship study, nalaman namin na ang isang compound na may C9 na binago sa ursonic acid, na tinatawag na nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), ay makabuluhang pinahuhusay ang inhibitory effect sa paglaki at pagtubo.Kapansin-pansin, naapektuhan din ng bagong natuklasang plant growth inhibitor ang paglaki ng tabako at liverwort at hindi ito cytotoxic sa bacteria o HeLa cells.Bukod dito, ang ilang mga urmotonic acid derivatives ay nag-uudyok ng isang distorted root phenotype, na nagpapahiwatig na ang mga derivatives na ito ay direkta o hindi direktang nakakaapekto sa mga microtubule.Alinsunod sa ideyang ito, ang aming mga obserbasyon sa mga microtubule na may label na immunohistochemically o may mga fluorescent na protina ay nagpapahiwatig na ang paggamot sa KAND ay nagde-depolymerize ng mga microtubule.Bilang karagdagan, ang paggamot na may kumamotonic acid derivatives ay nakakagambala sa mga microfilament ng actin.Kaya, natuklasan namin ang isang bagong inhibitor ng paglago ng halaman na ang natatanging mekanismo ng pagkilos ay nagsasangkot ng pagkasira ng cytoskeleton.
Ang strain MK493-CF1 ay nahiwalay sa lupa sa Shinagawa-ku, Tokyo.Ang strain MK493-CF1 ay nabuo nang maayos ang stromal mycelium.Ang bahagyang pagkakasunud-sunod ng 16S ribosomal RNA gene (1422 bp) ay natukoy.Ang strain na ito ay halos kapareho sa S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipikal na strain, 99.93%).Batay sa resultang ito, natukoy na ang strain na ito ay malapit na nauugnay sa uri ng strain ng S. werraensis.Samakatuwid, pansamantala naming pinangalanan itong strain na S. werraensis MK493-CF1.Gumagawa din ng parehong bioactive compound ang S. werraensis ISP 5486T.Dahil kakaunti ang maagang pananaliksik sa pagkuha ng mga natural na produkto mula sa mikroorganismo na ito, isinagawa ang karagdagang pananaliksik sa kemikal.Pagkatapos ng paglilinang ng S. werraensis MK493-CF1 sa daluyan ng barley sa pamamagitan ng solid-state fermentation sa 30°C sa loob ng 14 na araw, ang daluyan ay nakuha na may 50% EtOH.Ang 60 ml ng sample ay pinatuyo upang makakuha ng 59.5 mg ng crude extract.Ang crude extract ay sumailalim sa reverse phase HPLC upang bigyan ang N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, pinangalanang coumamonamide, 36.0 mg).Ang kabuuang halaga ng 1 ay humigit-kumulang 60% ng crude extract.Samakatuwid, nagpasya kaming pag-aralan nang detalyado ang mga katangian ng kumamotoamide 1.
Ang Coumamonamide 1 ay isang puting amorphous powder at high resolution mass spectrometry (HRESIMS) ay nagpapatunay ng C6H8N2O2 (Fig. 1).Ang C2-substituted pyrrole fragment ng tambalang ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH sa 1H NMR spectrum: 4.5 Hz , H-5) at δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), at ang 13C NMR spectrum ay nagpapakita ng pagkakaroon ng apat na sp2 carbon atoms.Ang pagkakaroon ng isang pangkat ng amide sa posisyon ng C2 ay nasuri ng ugnayan ng HMBC mula sa C-3 proton hanggang sa amide carbonyl carbon sa δC 161.1.Bilang karagdagan, ang 1 H at 13 C NMR na mga taluktok sa δH 4.10 (3H, S) at δC 68.3 ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga pangkat ng N-methoxy sa molekula.Bagaman ang tamang posisyon ng pangkat na methoxy ay hindi pa natutukoy gamit ang spectroscopic analysis tulad ng pinahusay na pagkakaiba spectroscopy at nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), ang N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ang naging unang tambalan ng kandidato.
Upang matukoy ang tamang istraktura ng 1, isang kabuuang synthesis ang isinagawa (Larawan 2a).Ang paggamot sa 2-aminopyridine 2 sa komersyo na may m-CPBA ay nagresulta sa katumbas na N-oxide 3 sa dami ng ani.Matapos ang 2-aminoazidation ng 2, ang reaksyon ng cyclocondensation na inilarawan ni Abramovich ay isinagawa sa benzene sa 90 ° C upang makuha ang nais na 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 sa gramo.Bilis 60% (dalawang yugto).15,16.Ang methylation at hydrolysis ng 4 ay nagbigay ng 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (tinatawag na "cumotonic acid", 6) sa magandang ani (70%, dalawang hakbang).Sa wakas, ang amidation sa pamamagitan ng acid chloride intermediate 6 gamit ang aqueous ammonia ay nagbigay ng Kumamoto amide 1 sa 98% na ani.Ang lahat ng spectral data ng synthesized 1 ay katulad ng nakahiwalay na 1, kaya ang istraktura ng 1 ay natukoy;
Pangkalahatang synthesis at pagsusuri ng biological na aktibidad ng urbenamide at urbenic acid.(a) Kabuuang synthesis ng Kumamoto amide.(b) Ang pitong araw na wild-type na Arabidopsis Columbia (Col) na mga punla ay lumaki sa mga plato ng Murashige at Skoog (MS) na naglalaman ng coumamonamide 6 o coumamonamide 1 sa ipinahiwatig na mga konsentrasyon.Scale bar = 1 cm.
Una, sinuri namin ang mga biological na aktibidad ng urbenamide at ang mga intermediate nito para sa kanilang kakayahang baguhin ang paglago ng halaman.Nagdagdag kami ng iba't ibang konsentrasyon ng ursmonamide 1 o ursmonic acid 6 sa medium ng MS agar at mga kulturang Arabidopsis thaliana na punla sa medium na ito.Ang mga assay na ito ay nagpakita na ang mataas na konsentrasyon (500 μM) ng 6 ay humadlang sa paglaki ng ugat (Larawan 2b).Susunod, nakabuo kami ng iba't ibang mga derivatives sa pamamagitan ng pagpapalit sa posisyon ng N1 na 6 at nagsagawa ng mga pag-aaral ng relasyon sa istruktura-aktibidad sa kanila (ang proseso ng analogue synthesis ay inilarawan sa Supporting Information (SI)).Ang mga punla ng Arabidopsis ay lumaki sa isang daluyan na naglalaman ng 50 μM ursonic acid derivatives, at sinukat ang haba ng ugat.tulad ng ipinapakita sa larawan.Gaya ng ipinapakita sa Mga Figure 3a, b, at S1, ang mga coumamo acid ay may iba't ibang haba ng mga linear na alkoxy chain (9, 10, 11, 12, at 13) o malalaking alkoxy chain (15, 16, at 17) sa posisyon ng N1.Ang mga derivatives ay nagpakita ng makabuluhang pagsugpo sa paglago ng ugat.Bilang karagdagan, natagpuan namin na ang paglalapat ng 200 μM 10, 11, o 17 ay pumipigil sa pagtubo (Fig. 3c at S2).
Pag-aaral ng ugnayan ng istruktura-aktibidad ng Kumamoto amide at mga kaugnay na compound.(a) Iskema ng istruktura at synthesis ng mga analogue.(b) Ang dami ng haba ng ugat ng 7-araw na mga punla na lumago sa medium ng MS na mayroon o walang 50 μM na mga derivatives ng coumamonamide.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (t test, p< 0.05).n>18. Ang data ay ipinapakita bilang mean ± SD.Ang ibig sabihin ng nt ay "hindi nasubok" dahil higit sa 50% ng mga buto ay hindi tumubo.(c) Ang dami ng rate ng pagtubo ng ginagamot na mga buto na incubated para sa 7 araw sa MS medium na may o walang 200 μM coumamonamide at mga kaugnay na compound.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (chi-square test).n=96.
Kapansin-pansin, ang pagdaragdag ng mga alkyl side chain na mas mahaba kaysa sa C9 ay nagbawas sa aktibidad ng pagbabawal, na nagmumungkahi na ang mga compound na nauugnay sa kumamotoic acid ay nangangailangan ng mga side chain ng isang tiyak na laki upang ipakita ang kanilang biological na aktibidad.
Dahil ang pagtatasa ng ugnayan ng istruktura-aktibidad ay nagpakita na ang C9 ay binago sa ursonic acid at ang nonyloxy derivative ng ursonic acid (pagkatapos ay tinutukoy bilang KAND 11) ay ang pinaka-epektibong inhibitor ng paglago ng halaman, nagsagawa kami ng mas detalyadong paglalarawan ng KAND 11. Paggamot ng Arabidopsis na may 50 μM KAND 11 halos ganap na napigilan ang pagtubo, samantalang ang mas mababang konsentrasyon (40, 30, 20, o 10 μM) ng KAND 11 ay humadlang sa paglaki ng ugat sa paraang nakadepende sa dosis (Larawan 4a, b).Upang masubukan kung ang KAND 11 ay nakakaapekto sa root meristem viability, sinuri namin ang root meristem na nabahiran ng propidium iodide (PI) at sinukat ang laki ng meristem area.Ang laki ng meristem ng mga seedlings na lumago sa isang medium na naglalaman ng 25 μM KAND-11 ay 151.1 ± 32.5 μm, habang ang laki ng meristem ng mga seedlings na lumago sa isang control medium na naglalaman ng DMSO ay 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d). , na nagpapahiwatig na ang KAND-11 ay nagpapanumbalik ng aktibidad ng cellular.kumakalat.Root meristem.Alinsunod dito, binawasan ng paggamot ng KAND 11 ang dami ng cell division marker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signal sa root meristem (Fig. 4e) 17 .Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang KAND 11 ay pumipigil sa paglaki ng ugat sa pamamagitan ng pagbabawas ng aktibidad ng paglaganap ng cell.
Pagsusuri ng nagbabawal na epekto ng urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) sa paglago.(a) 7-araw na wild-type na Col seedlings na lumaki sa MS plates na may nakasaad na konsentrasyon ng KAND 11. Scale bar = 1 cm.(b) Quantification ng haba ng ugat.Ang mga titik ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba (Tukey HSD test, p< 0.05).n>16. Ang data ay ipinapakita bilang mean ± SD.(c) Confocal microscopy ng propidium iodide-stained wild-type Col roots na lumago sa MS plates na may o walang 25 μM KAND 11. Ang mga puting bracket ay nagpapahiwatig ng root meristem.Scale bar = 100 µm.(d) Quantification ng root meristem size (n = 10 hanggang 11).Natukoy ang mga pagkakaiba sa istatistika gamit ang t-test (p< 0.05).Ang mga bar ay kumakatawan sa average na laki ng meristem.(e) Differential interference contrast (DIC) microscopy ng root meristem na naglalaman ng CDKB2 construct;1pro: CDKB2;1-GUS na nabahiran at nabahiran sa 5-araw na gulang na mga punla na lumaki sa mga MS plate na mayroon o walang 25 µM KAND assay.
Ang phytotoxicity ng KAND 11 ay karagdagang nasubok gamit ang isa pang dicotyledonous na halaman, tabako (Nicotiana tabacum), at isang pangunahing organismo ng modelo ng land plant, liverwort (Marchantia polymorpha).Tulad ng kaso ng Arabidopsis, ang mga punla ng tabako SR-1 na lumago sa medium na naglalaman ng 25 μM KAND 11 ay gumawa ng mas maikling mga ugat (Larawan 5a).Bilang karagdagan, 40 sa 48 na buto ang tumubo sa mga plato na naglalaman ng 200 μM KAND 11, samantalang ang lahat ng 48 na buto ay tumubo sa mock-treated na media, na nagpapahiwatig na ang mas mataas na konsentrasyon ng KAND ay makabuluhan (p< 0.05;chi test -square) inhibited ang pagtubo ng tabako.(Larawan 5b).Bilang karagdagan, ang konsentrasyon ng KAND 11 na pumipigil sa paglaki ng bakterya sa liverwort ay katulad ng epektibong konsentrasyon sa Arabidopsis (Larawan 5c).Isinasaad ng mga resultang ito na maaaring pigilan ng KAND 11 ang paglaki ng iba't ibang halaman.Pagkatapos ay sinisiyasat namin ang posibleng cytotoxicity ng bear monoamide-related compound sa iba pang mga organismo, katulad ng mga human HeLa cells at Escherichia coli strain DH5α, bilang mga kinatawan ng mas mataas na mga selula ng hayop at bacterial, ayon sa pagkakabanggit.Sa isang serye ng mga cell proliferation assays, napansin namin na ang coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, at KAND 11 ay hindi nakakaapekto sa paglaki ng HeLa o E. coli cells sa mga konsentrasyon na 100 μM (Fig. 5d, e).
Ang pagsugpo sa paglaki ng KAND 11 sa mga non-Arabidopsis na organismo.(a) Dalawang linggong gulang na wild-type na SR-1 na mga punla ng tabako ay itinanim sa patayong nakaposisyon na mga plato ng MS na naglalaman ng 25 μM KAND 11. (b) Ang dalawang linggong gulang na wild-type na SR-1 na mga punla ng tabako ay itinanim sa pahalang na nakaposisyon MS plates na naglalaman ng 200 μM KAND 11. ( c) Dalawang linggong gulang na wild-type Tak-1 liverwort buds na lumaki sa Gamborg B5 plates na may nakasaad na konsentrasyon ng KAND 11. Ang mga pulang arrow ay nagpapahiwatig ng mga spore na tumigil sa paglaki sa loob ng dalawang linggong pagpapapisa ng itlog panahon.(d) Pagsusuri ng paglaganap ng cell ng mga selula ng HeLa.Ang bilang ng mga mabubuhay na cell ay sinusukat sa mga nakapirming agwat ng oras gamit ang isang cell counting kit 8 (Dojindo).Bilang isang kontrol, ang mga selula ng HeLa ay ginagamot ng 5 μg/ml actinomycin D (Act D), na pumipigil sa transkripsyon ng RNA polymerase at nagiging sanhi ng pagkamatay ng cell.Ang mga pagsusuri ay isinagawa sa triplicate.(e) E. coli cell proliferation assay.Ang paglaki ng E. coli ay sinuri sa pamamagitan ng pagsukat ng OD600.Bilang isang kontrol, ang mga cell ay ginagamot ng 50 μg/ml na ampicillin (Amp), na pumipigil sa bacterial cell wall synthesis.Ang mga pagsusuri ay isinagawa sa triplicate.
Upang matukoy ang mekanismo ng pagkilos ng cytotoxicity na dulot ng mga compound na nauugnay sa uramide, muling sinuri namin ang mga derivatives ng urbenic acid na may katamtamang mga epekto sa pagbawalan.tulad ng ipinapakita sa larawan.Tulad ng ipinapakita sa Figures 2b, 6a, ang mga seedlings na lumago sa agar plates na naglalaman ng mataas na konsentrasyon (200 μM) ng urmotonic acid 6 ay gumawa ng mas maikli at left-curved na mga ugat (θ = - 23.7 ± 6.1), samantalang ang mga seedlings na lumago sa control medium, ang ang mga punla ay nagbunga ng halos tuwid na mga ugat (θ = – 3.8 ± 7.1).Ang katangiang pahilig na paglaki na ito ay kilala na nagreresulta mula sa dysfunction ng cortical microtubule14,18.Alinsunod sa paghahanap na ito, ang mga microtubule-destabilizing na gamot na disopyramide at oryzalin ay nag-udyok ng katulad na pagkiling ng ugat sa ilalim ng aming mga kondisyon ng paglago (Fig. 2b, 6a).Kasabay nito, sinubukan namin ang mga derivatives ng urmotonic acid at pinili ang ilan sa mga ito na, sa ilang mga konsentrasyon, ay nag-udyok ng pahilig na paglaki ng ugat.Binago ng mga compound 8, 9, at 15 ang direksyon ng paglaki ng ugat sa 75 μM, 50 μM, at 40 μM, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapahiwatig na ang mga compound na ito ay maaaring epektibong ma-destabilize ang mga microtubule (Larawan 2b, 6a).Sinubukan din namin ang pinaka-makapangyarihang ursolic acid derivative, KAND 11, sa isang mas mababang konsentrasyon (15 µM) at nalaman na ang paglalapat ng KAND 11 ay humadlang sa paglago ng ugat at ang direksyon ng paglaki ng ugat ay hindi pantay, bagama't sila ay may posibilidad na slope sa kaliwa ( Larawan C3)..Dahil ang mas mataas na konsentrasyon ng mga microtubule-destabilizing na gamot ay minsan ay pumipigil sa paglago ng halaman sa halip na maging sanhi ng pagkiling ng ugat, pagkatapos ay nasuri namin ang posibilidad na ang KAND 11 ay nakakaapekto sa mga microtubule sa pamamagitan ng pagmamasid sa mga cortical microtubule sa mga root epidermal cells.Ang immunohistochemistry gamit ang mga anti-β-tubulin antibodies sa mga epidermal cells ng mga ugat ng punla na ginagamot ng 25 μM KAND 11 ay nagpakita ng pagkawala ng halos lahat ng cortical microtubules sa mga epidermal cells sa elongation zone (Fig. 6b).Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang kumamotonic acid at ang mga derivatives nito ay kumikilos nang direkta o hindi direkta sa mga microtubule upang guluhin ang mga ito at ang mga compound na ito ay mga nobelang microtubule inhibitors.
Ang Ursonic acid at ang mga derivatives nito ay nagbabago ng cortical microtubule sa Arabidopsis thaliana.(a) Ang anggulo ng pagkahilig ng ugat ay sinusukat sa pagkakaroon ng iba't ibang mga derivatives ng urmotonic acid sa ipinahiwatig na mga konsentrasyon.Ang mga epekto ng dalawang compound na kilala na pumipigil sa microtubule: disopyramide at oryzalin ay nasuri din.Ipinapakita ng inset ang pamantayang ginamit upang sukatin ang anggulo ng paglago ng ugat.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (t test, p< 0.05).n>19. Scale bar = 1 cm.(b) Cortical microtubule sa mga epidermal cells sa elongation zone.Ang mga microtubule sa wild-type na Arabidopsis Col na mga ugat na lumago sa mga plato ng MS na may o walang 25 μM KAND 11 ay na-visualize sa pamamagitan ng immunohistochemical staining gamit ang β-tubulin primary antibodies at Alexa Fluor-conjugated pangalawang antibodies.Scale bar = 10 µm.(c) Mitotic na istraktura ng microtubule sa root meristem.Ang mga microtubule ay na-visualize gamit ang immunohistochemical staining.Ang mga istrukturang mitotic, kabilang ang mga prophase zone, spindle, at phragmoplast, ay binibilang mula sa mga confocal na imahe.Ang mga arrow ay nagpapahiwatig ng mga istruktura ng mitotic microtubule.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (t test, p< 0.05).n>9. Scale bar = 50 µm.
Bagama't may kakayahan si Ursa na guluhin ang pag-andar ng microtubule, ang mekanismo ng pagkilos nito ay inaasahang iba sa mga karaniwang microtubule depolymerizing agent.Halimbawa, ang mas mataas na konsentrasyon ng mga microtubule depolymerizing agent tulad ng disopyramide at oryzalin ay nag-uudyok ng anisotropic na pagpapalawak ng mga epidermal cells, samantalang ang KAND 11 ay hindi.Sa karagdagan, ang co-application ng KAND 11 at disopyramide ay nagresulta sa pinagsamang disopyramide-induced root growth response at KAND 11-induced growth inhibition ay naobserbahan (Fig. S4).Sinuri din namin ang tugon ng hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant sa KAND 11. Ang phs1-1 ay may non-canonical tubulin kinase point mutation at gumagawa ng mas maikling mga ugat kapag ginagamot sa disopyramide9,20.Ang phs1-1 mutant seedlings na lumaki sa agar medium na naglalaman ng KAND 11 ay may mas maiikling ugat na katulad ng mga tumubo sa disopyramid (fig. S5).
Bilang karagdagan, napansin namin ang mga istrukturang mitotic microtubule, tulad ng mga prophase zone, spindle, at phragmoplast, sa root meristem ng mga seedling na ginagamot sa KAND 11. Alinsunod sa mga obserbasyon para sa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, isang makabuluhang pagbaba sa ang bilang ng mitotic microtubule ay naobserbahan (Fig. 6c).
Upang makilala ang cytotoxicity ng KAND 11 sa subcellular resolution, tinatrato namin ang tobacco BY-2 suspension cells na may KAND 11 at sinusunod ang kanilang tugon.Una naming idinagdag ang KAND 11 sa BY-2 na mga cell na nagpapahayag ng TagRFP-TUA6, na fluorescently na naglalagay ng label sa mga microtubule, upang masuri ang epekto ng KAND 11 sa cortical microtubule.Nasuri ang density ng cortical microtubule gamit ang pagsusuri ng imahe, na binibilang ang porsyento ng mga cytoskeletal pixel sa mga cytoplasmic pixel.Ang mga resulta ng assay ay nagpakita na pagkatapos ng paggamot na may 50 μM o 100 μM KAND 11 para sa 1 oras, ang density ay bumaba nang malaki sa 0.94 ± 0.74% o 0.23 ± 0.28%, ayon sa pagkakabanggit, habang ang density ng mga cell na ginagamot sa DMSO, ay umabot sa 1.61 ± 0.34. % (Larawan 7a).Ang mga resulta na ito ay pare-pareho sa obserbasyon sa Arabidopsis na ang paggamot ng KAND 11 ay nag-uudyok ng depolymerization ng cortical microtubule (Larawan 6b).Sinuri din namin ang linya ng BY-2 na may mga filament ng actin na may label na GFP-ABD pagkatapos ng paggamot na may parehong konsentrasyon ng KAND 11 at napansin na ang paggamot ng KAND 11 ay nakagambala sa mga filament ng actin.Ang paggamot na may 50 μM o 100 μM KAND 11 para sa 1 h ay makabuluhang nabawasan ang density ng filament ng actin sa 1.20 ± 0.62% o 0.61 ± 0.26%, ayon sa pagkakabanggit, samantalang ang density sa mga cell na ginagamot ng DMSO ay 1.69 ± 0.51% (Fig.7b).Ang mga resultang ito ay kaibahan sa mga epekto ng propyzamide, na hindi nakakaapekto sa actin filament, at latrunculin B, isang actin depolymerizer na hindi nakakaapekto sa microtubule (SI Figure S6).Bilang karagdagan, ang paggamot na may coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, o KAND 11 ay hindi nakakaapekto sa mga microtubule sa mga HeLa cells (SI Figure S7).Kaya, ang mekanismo ng pagkilos ng KAND 11 ay pinaniniwalaan na iba sa mga kilalang cytoskeleton disruptor.Bilang karagdagan, ang aming mikroskopikong pagmamasid sa mga BY-2 na mga cell na ginagamot sa KAND 11 ay nagsiwalat ng simula ng pagkamatay ng cell sa panahon ng paggamot ng KAND 11 at ipinakita na ang proporsyon ng mga Evans na may asul na mga patay na selula ay hindi tumaas nang malaki pagkatapos ng 30 min ng paggamot ng KAND 11, samantalang pagkatapos ng 90 minuto ng paggamot na may 50 μM o 100 μM KAND, ang bilang ng mga patay na selula ay tumaas sa 43.7% o 80.1%, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 7c).Kung pinagsama-sama, ang mga datos na ito ay nagpapahiwatig na ang nobelang ursolic acid derivative na KAND 11 ay isang cytoskeletal inhibitor na tukoy sa halaman na may dating hindi kilalang mekanismo ng pagkilos.
Naaapektuhan ng KAND ang mga cortical microtubule, actin filament, at viability ng tobacco BY-2 cells.(a) Visualization ng cortical microtubule sa BY-2 cells sa pagkakaroon ng TagRFP-TUA6.Ang mga cell ng BY-2 na ginagamot sa KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO ay sinuri ng confocal microscopy.Ang density ng cortical microtubule ay kinakalkula mula sa mga micrograph ng 25 independiyenteng mga cell.Ang mga titik ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba (Tukey HSD test, p< 0.05).Scale bar = 10 µm.( b ) Cortical actin filament sa BY-2 na mga cell na nakikita sa pagkakaroon ng GFP-ABD2.Ang mga cell ng BY-2 na ginagamot sa KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO ay sinuri ng confocal microscopy.Ang density ng cortical actin filament ay kinakalkula mula sa micrographs ng 25 independiyenteng mga cell.Ang mga titik ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba (Tukey HSD test, p< 0.05).Scale bar = 10 µm.(c) Pagmamasid sa mga patay na BY-2 na selula sa pamamagitan ng paglamlam ng asul na Evans.Ang mga cell ng BY-2 na ginagamot sa KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO ay sinuri ng maliwanag na field microscopy.n=3.Scale bar = 100 µm.
Ang pagtuklas at paggamit ng mga bagong likas na produkto ay humantong sa makabuluhang pagsulong sa iba't ibang aspeto ng buhay ng tao, kabilang ang medisina at agrikultura.Ang makasaysayang pananaliksik ay isinagawa upang makakuha ng mga kapaki-pakinabang na compound mula sa mga likas na yaman.Sa partikular, ang actinomycetes ay kilala na kapaki-pakinabang bilang antiparasitic antibiotics para sa nematodes dahil sa kanilang kakayahang gumawa ng iba't ibang pangalawang metabolites tulad ng avermectin, ang lead compound ng ivermectin at bleomycin at mga derivatives nito, na ginagamit bilang isang anticancer agent21,22.Gayundin, ang iba't ibang mga herbicidal compound ay natuklasan mula sa actinomycetes, na ang ilan ay ginagamit na sa komersyo1,23.Samakatuwid, ang pagsusuri ng actinomycete metabolites upang ihiwalay ang mga natural na produkto na may nais na biological na aktibidad ay itinuturing na isang epektibong diskarte.Sa pag-aaral na ito, natuklasan namin ang isang bagong tambalan, coumamonamide, mula sa S. werraensis at matagumpay na na-synthesize ito.Ang Ursonic acid ay isang synthetic intermediate ng urbenamide at mga derivatives nito.Maaari itong magdulot ng katangiang pagkulot ng ugat, nagpapakita ng katamtaman hanggang malakas na aktibidad ng herbicidal, at direkta o hindi direktang makapinsala sa mga microtubule ng halaman.Gayunpaman, ang mekanismo ng pagkilos ng urmotonic acid ay maaaring naiiba mula sa umiiral na mga microtubule inhibitors, dahil ang KAND 11 ay nakakagambala din sa mga filament ng actin at nagiging sanhi ng pagkamatay ng cell, na nagmumungkahi ng isang mekanismo ng regulasyon kung saan ang urmotonic acid at ang mga derivatives nito ay nakakaimpluwensya sa isang malawak na hanay ng mga istruktura ng cytoskeletal..
Ang karagdagang detalyadong paglalarawan ng urbenonic acid ay makakatulong upang mas maunawaan ang mekanismo ng pagkilos ng urbenonic acid.Sa partikular, ang susunod na layunin ay suriin ang kakayahan ng ursonic acid na magbigkis sa mga pinababang microtubule upang matukoy kung ang ursonic acid at ang mga derivatives nito ay direktang kumikilos sa microtubule at depolymerize ang mga ito, o kung ang kanilang pagkilos ay nagreresulta sa microtubule destabilization.Bilang karagdagan, sa kaso kung saan ang mga microtubule ay hindi direktang target, ang pagtukoy sa lugar ng pagkilos at mga molekular na target ng ursonic acid sa mga selula ng halaman ay makakatulong sa higit pang maunawaan ang mga katangian ng mga kaugnay na compound at posibleng mga paraan upang mapabuti ang aktibidad ng herbicidal.Ang aming bioactivity assay ay nagsiwalat ng natatanging cytotoxic na kakayahan ng ursonic acid sa paglago ng mga halaman tulad ng Arabidopsis thaliana, tabako at liverwort, habang hindi apektado ang E. coli o ang mga HeLa cells.Ang kaunti o walang toxicity sa mga selula ng hayop ay isang kalamangan ng ursonic acid derivatives kung ang mga ito ay binuo bilang mga herbicide para magamit sa mga bukas na larangan ng agrikultura.Sa katunayan, dahil ang mga microtubule ay karaniwang mga istruktura sa mga eukaryote, ang kanilang pumipili na pagsugpo sa mga halaman ay isang pangunahing kinakailangan para sa mga herbicide.Halimbawa, ang propyzamide, isang microtubule depolymerizing agent na direktang nagbubuklod sa tubulin at pumipigil sa polymerization, ay ginagamit bilang herbicide dahil sa mababang toxicity nito sa mga selula ng hayop24.Sa kaibahan sa disopyramide, ang mga kaugnay na benzamide ay may iba't ibang mga pagtukoy sa target.Bilang karagdagan sa mga microtubule ng halaman, pinipigilan din ng RH-4032 o benzoxamide ang mga microtubule ng mga selula ng hayop o oomycetes, ayon sa pagkakabanggit, at ang zalilamide ay ginagamit bilang fungicide dahil sa mababang phytotoxicity nito25,26,27.Ang bagong natuklasan na oso at ang mga derivatives nito ay nagpapakita ng selective cytotoxicity laban sa mga halaman, ngunit ito ay nagkakahalaga ng pagpuna na ang karagdagang mga pagbabago ay maaaring magbago ng kanilang target na pagtitiyak, potensyal na magbigay ng karagdagang mga derivatives para sa kontrol ng pathogenic fungi o oomycetes.
Ang mga natatanging katangian ng urbenonic acid at mga derivatives nito ay kapaki-pakinabang para sa kanilang pag-unlad bilang mga herbicide at ginagamit bilang mga tool sa pananaliksik.Ang kahalagahan ng cytoskeleton sa pagkontrol sa hugis ng cell ng halaman ay malawak na kinikilala.Ang mga naunang pag-aaral ay nagpakita na ang mga halaman ay nagbago ng mga kumplikadong mekanismo ng cortical microtubule na organisasyon sa pamamagitan ng pagkontrol sa microtubule dynamics upang maayos na makontrol ang morphogenesis.Ang isang malaking bilang ng mga molekula na responsable para sa regulasyon ng aktibidad ng microtubule ay natukoy, at ang kaugnay na pananaliksik ay patuloy pa rin3,4,28.Ang aming kasalukuyang pag-unawa sa microtubule dynamics sa mga cell ng halaman ay hindi ganap na nagpapaliwanag sa mga mekanismo ng cortical microtubule na organisasyon.Halimbawa, bagaman ang parehong disopyramide at oryzalin ay maaaring mag-depolymerize ng mga microtubule, ang disopyramide ay nagdudulot ng matinding pagbaluktot sa ugat habang ang oryzalin ay may medyo banayad na epekto.Bukod dito, ang mga mutasyon sa tubulin, na nagpapatatag ng mga microtubule, ay nagdudulot din ng dextrorotation sa mga ugat, samantalang ang paclitaxel, na nagpapatatag din ng microtubule dynamics, ay hindi.Samakatuwid, ang pag-aaral at pagtukoy sa mga molekular na target ng ursolic acid ay dapat magbigay ng mga bagong pananaw sa regulasyon ng mga cortical microtubule ng halaman.Gayundin, ang mga paghahambing sa hinaharap ng mga kemikal na epektibo sa pagtataguyod ng hindi magandang paglaki, tulad ng disopyramide, at mga hindi gaanong epektibong kemikal, tulad ng oryzalin o kumamotoric acid, ay magbibigay ng mga pahiwatig kung paano nangyayari ang distorted growth.
Sa kabilang banda, ang mga pagbabago sa cytoskeletal na nauugnay sa pagtatanggol ay isa pang posibilidad na ipaliwanag ang cytotoxicity ng ursonic acid.Ang impeksyon ng isang pathogen o pagpapakilala ng isang elicitor sa mga selula ng halaman kung minsan ay nagiging sanhi ng pagkasira ng cytoskeleton at kasunod na pagkamatay ng cell29.Halimbawa, ang cryptoxanthin na nagmula sa oomycete ay naiulat na nakakagambala sa mga microtubule at actin filament bago ang pagkamatay ng cell ng tabako, katulad ng nangyayari sa paggamot ng KAND30,31.Ang mga pagkakatulad sa pagitan ng mga tugon sa pagtatanggol at mga tugon ng cellular na dulot ng ursonic acid ay humantong sa amin sa hypothesize na nagti-trigger sila ng mga karaniwang proseso ng cellular, bagama't ang isang mas mabilis at mas malakas na epekto ng ursonic acid kaysa sa cryptoxanthin ay maliwanag.Gayunpaman, ipinakita ng mga pag-aaral na ang pagkagambala ng mga filament ng actin ay nagtataguyod ng kusang pagkamatay ng cell, na hindi palaging sinamahan ng pagkagambala ng microtubule29.Sa karagdagan, ito ay nananatiling upang makita kung ang alinman sa pathogen o elicitor ay nagiging sanhi ng pangit na paglaki ng ugat, tulad ng ursonic acid derivatives.Kaya, ang kaalaman sa molekular na nag-uugnay sa mga tugon sa pagtatanggol at ang cytoskeleton ay isang kaakit-akit na problema na dapat matugunan.Sa pamamagitan ng pagsasamantala sa pagkakaroon ng mababang molekular na timbang na mga compound na nauugnay sa ursonic acid, pati na rin ang isang hanay ng mga derivatives na may iba't ibang potensyal, maaari silang magbigay ng mga pagkakataon upang i-target ang hindi kilalang mga mekanismo ng cellular.
Kung pinagsama-sama, ang pagtuklas at paggamit ng mga bagong compound na nagmo-modulate ng microtubule dynamics ay magbibigay ng makapangyarihang mga pamamaraan upang matugunan ang mga kumplikadong mekanismo ng molekular na pinagbabatayan ng pagpapasiya ng hugis ng cell ng halaman.Sa kontekstong ito, ang kamakailang binuo na tambalang urmotonic acid, na nakakaapekto sa mga microtubule at actin filament at nagdudulot ng pagkamatay ng cell, ay maaaring magbigay ng pagkakataong matukoy ang koneksyon sa pagitan ng kontrol ng microtubule at ng iba pang mga mekanismong ito.Kaya, ang pagsusuri ng kemikal at biyolohikal gamit ang urbenonic acid ay makakatulong sa amin na maunawaan ang mga mekanismo ng regulasyon ng molekular na kumokontrol sa cytoskeleton ng halaman.
Inoculate ang S. werraensis MK493-CF1 sa isang 500 mL baffled Erlenmeyer flask na naglalaman ng 110 mL ng seed medium na binubuo ng 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% ( w/v) Bacto composition .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) corn extract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 at 0.2% CaCO3 sa deionized na tubig.(pH 7.4 bago isterilisasyon).Ang mga kultura ng binhi ay natupok sa isang rotary shaker (180 rpm) sa 27 ° C sa loob ng 2 araw.Paglilinang ng produksyon sa pamamagitan ng solid state fermentation.Ang seed culture (7 ml) ay inilipat sa isang 500 ml K-1 flask na naglalaman ng 40 g ng production medium na binubuo ng 15 g ng pressed barley (MUSO Co., Ltd., Japan) at 25 g ng deionized water (pH not adjusted). bago isterilisasyon).).Ang pagbuburo ay isinasagawa sa 30°C sa dilim sa loob ng 14 na araw.Ang materyal ng pagbuburo ay nakuha gamit ang 40 ml/bote na EtOH at na-centrifuge (1500 g, 4°C, 10 min).Ang supernatant ng kultura (60 ml) ay nakuha na may halo ng 10% MeOH/EtOAc.Ang organikong layer ay sumingaw sa ilalim ng pinababang presyon upang makakuha ng nalalabi (59.5 mg), na sumailalim sa HPLC na may gradient elution (0-10 minuto: 90%) sa isang reverse phase column (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × haba 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuto: 90% H2O/CH3CN hanggang 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuto: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuto: 90% H2O /EtOH hanggang 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) sa rate ng daloy na 1.5 ml/min, ang coumamonamide (1, 36.0 mg) ay nahiwalay bilang puting amorphous powder.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nakalkulang halaga: 141.0659, sinusukat na halaga: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1538 cm
Ang mga buto ng Columbia (Col-0) ay nakuha mula sa Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) na may pahintulot para sa paggamit ng pananaliksik.Ang mga buto ng Col-0 ay pinalaganap at pinananatili sa ilalim ng aming mga kondisyon sa laboratoryo at ginamit bilang mga wild-type na Arabidopsis na halaman.Ang mga buto ng Arabidopsis ay isterilisado sa ibabaw at nilinang sa kalahating lakas na Murashige at Skoog medium na naglalaman ng 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) at 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, sa 23 °C at pare-parehong liwanag.Ang mga buto ng phs1-1 mutant ay ibinigay ni T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ang mga buto ng strain SR-1 ay ibinigay ni T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) at ginamit bilang wild-type na mga halaman ng tabako.Ang mga buto ng tabako ay isterilisado sa ibabaw at ibinabad sa sterile na tubig sa loob ng tatlong gabi upang isulong ang pagtubo, pagkatapos ay inilagay sa isang kalahating lakas na solusyon na naglalaman ng 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, at 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.at Skoog medium) na may pH 5.7 at incubated sa 23°C sa ilalim ng palaging liwanag.
Ang Strain Tak-1 ay ibinigay ng T. Kohchi (Kyoto University) at ginamit bilang standard experimental unit para sa liverwort study.Ang Gemma ay nakuha mula sa mga isterilisadong kulturang halaman at pagkatapos ay inilagay sa Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) na naglalaman ng 1% sucrose at 0.3% gellan gum at na-incubated sa 23°C sa ilalim ng tuluy-tuloy na liwanag.
Tobacco BY-2 cells (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ay ibinigay ni S. Hasezawa (University of Tokyo).Ang mga cell ng BY-2 ay natunaw ng 95-tiklop sa binagong Linsmeier at Skoog medium at dinagdagan lingguhan ng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 .Ang suspensyon ng cell ay pinaghalo sa isang rotary shaker sa 130 rpm sa 27 ° C sa dilim.Hugasan ang mga cell na may 10 beses na dami ng sariwang medium at muling pagsuspinde sa parehong medium.Ang mga linya ng BY-2 transgenic cell na matatag na nagpapahayag ng microtubule marker na TagRFP-TUA6 o ang actin filament marker na GFP-ABD2 sa ilalim ng cauliflower mosaic virus 35S promoter ay nabuo tulad ng inilarawan33,34,35.Ang mga linya ng cell na ito ay maaaring panatilihin at i-synchronize gamit ang mga pamamaraan na katulad ng mga ginamit para sa orihinal na linya ng cell na BY-2.
Ang mga selula ng HeLa ay na-culture sa Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) na dinagdagan ng 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, at 1.2 μg/ml streptomycin sa isang 37°C incubator na may 5% CO2.
Ang lahat ng mga eksperimento na inilarawan sa manuskrito na ito ay isinagawa alinsunod sa mga regulasyon at alituntunin ng biosafety ng Hapon.
Ang mga compound ay natunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) bilang mga solusyon sa stock at diluted sa MS medium para sa Arabidopsis at tabako o Gamborg B5 medium para sa liverwort.Para sa root growth inhibition assay, higit sa 10 buto bawat plato ang inihasik sa agar medium na naglalaman ng mga ipinahiwatig na compound o DMSO.Ang mga buto ay incubated sa isang growth chamber sa loob ng 7 araw.Kinunan ng litrato ang mga punla at sinukat ang haba ng mga ugat.Para sa Arabidopsis germination assay, 48 na buto bawat plato ang inihasik sa agar medium na naglalaman ng 200 μM compound o DMSO.Ang mga buto ng Arabidopsis ay lumago sa isang silid ng paglaki at ang bilang ng mga tumubo na punla ay binibilang 7 araw pagkatapos ng pagtubo (dag).Para sa pagtatasa ng pagtubo ng tabako, 24 na buto bawat plato ang inihasik sa agar medium na naglalaman ng 200 μM KAND o DMSO.Ang mga buto ng tabako ay itinanim sa isang silid ng paglaki at ang bilang ng mga tumubo na punla ay binibilang pagkatapos ng 14 na araw.Para sa liverwort growth inhibition assay, 9 na mga embryo mula sa bawat plato ang nilagyan ng agar medium na naglalaman ng mga ipinahiwatig na konsentrasyon ng KAND o DMSO at na-incubate sa isang growth chamber sa loob ng 14 na araw.
Gumamit ng mga seedling na nabahiran ng 5 mg/ml propidium iodide (PI) para makita ang root meristem organization.Ang mga signal ng PI ay sinusunod ng fluorescence microscopy gamit ang isang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).
Ang histochemical staining ng mga ugat na may β-glucuronidase (GUS) ay isinagawa ayon sa protocol na inilarawan ni Malami at Benfey36.Ang mga punla ay naayos sa 90% acetone magdamag, nalagyan ng batik ng 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid sa GUS buffer sa loob ng 1 oras at inilagay sa isang hydrated chloraldehyde solution.(8 g chloral hydrate, 2 ml na tubig at 1 ml glycerol) at naobserbahan sa pamamagitan ng differential interference contrast microscopy gamit ang isang Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss).
Ang mga anggulo ng ugat ay sinusukat sa 7-araw na mga punla na lumago sa patayong inilagay na mga plato.Sukatin ang anggulo ng ugat mula sa direksyon ng gravity vector gaya ng inilarawan sa hakbang 6.
Ang pag-aayos ng mga cortical microtubule ay sinusunod tulad ng inilarawan, na may mga menor de edad na pagbabago sa protocol 37 .Ang anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) at Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ay ginamit bilang pangunahin at pangalawang antibodies sa 1:1000 at 1:100 dilutions, ayon sa pagkakabanggit.Ang mga imahe ng fluorescence ay nakuha gamit ang isang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).Kumuha ng Z-stack na mga imahe at lumikha ng maximum na intensity projection ayon sa mga tagubilin ng gumawa.
Ang HeLa cell proliferation assay ay isinagawa gamit ang Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.
Ang paglaki ng E. coli DH5α ay nasuri sa pamamagitan ng pagsukat ng density ng cell sa kultura gamit ang isang spectrophotometer sa 600 nm (OD600).
Ang samahan ng cytoskeletal sa transgenic BY-2 na mga cell ay sinusunod gamit ang isang fluorescence microscope na nilagyan ng isang CSU-X1 confocal scanning device (Yokogawa) at isang sCMOS camera (Zyla, Andor Technology).Ang density ng cytoskeletal ay nasuri sa pamamagitan ng pagsusuri ng imahe, na binibilang ang porsyento ng mga cytoskeletal pixel sa mga cytoplasmic pixel sa mga confocal na imahe gamit ang ImageJ software tulad ng inilarawan 38, 39.
Upang makita ang pagkamatay ng cell sa mga cell ng BY-2, ang isang aliquot ng suspensyon ng cell ay natupok ng 0.05% na asul na Evans sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid.Ang selective Evans na asul na paglamlam ng mga patay na selula ay nakasalalay sa pag-extrusion ng tina mula sa mga mabubuhay na selula sa pamamagitan ng buo na lamad ng plasma40.Ang mga stained cell ay sinusunod gamit ang isang maliwanag na field microscope (BX53, Olympus).
Ang mga selula ng HeLa ay lumaki sa DMEM na dinagdagan ng 10% FBS sa isang humidified incubator sa 37°C at 5% CO2.Ang mga cell ay ginagamot ng 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), o 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) sa loob ng 6 na oras sa 37 ° C.Ang mga cell ay naayos na may MetOH sa loob ng 10 min at pagkatapos ay may acetate para sa 5 min sa temperatura ng silid.Ang mga nakapirming cell ay na-incubate ng β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) na natunaw sa 0.5% BSA/PBS sa loob ng 2 oras, hinugasan ng 3 beses gamit ang TBST, at pagkatapos ay na-incubate ng Alexa Fluor goat antibody.488 1 oras.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) at 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) na diluted sa 0.5% BSA/PBS.Matapos maghugas ng TBST ng tatlong beses, ang mga stained cell ay naobserbahan sa isang Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope.Ang mga imahe ay nakunan gamit ang isang cooled Hamamatsu ORCA-R2 CCD camera gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Oras ng post: Hun-17-2024