Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamahusay na resulta, inirerekomenda namin na gumamit ka ng mas bagong bersyon ng iyong browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site nang walang styling o JavaScript.
Ang pagtuklas at kapaki-pakinabang na paggamit ng mga natural na produkto ay makakatulong na mapabuti ang buhay ng tao. Ang mga kemikal na pumipigil sa paglaki ng halaman ay malawakang ginagamit bilang mga herbicide upang makontrol ang mga damo. Dahil sa pangangailangang gumamit ng iba't ibang uri ng herbicide, may pangangailangang tukuyin ang mga compound na may mga bagong mekanismo ng pagkilos. Sa pag-aaral na ito, natuklasan namin ang isang nobelang N-alkoxypyrrole compound, ang coumamonamide, mula sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 at itinatag ang kumpletong proseso ng sintesis. Sa pamamagitan ng mga biological activity assay, natuklasan namin na ang urs-monoamic acid ay isang sintetikong intermediate ng urs-monoamide at isang potensyal na...pangpigil sa paglaki ng halamanBukod pa rito, nakabuo kami ng iba't ibang urbenonic acid derivatives, kabilang ang urbenyloxy derivative (UDA), na may mataas na herbicidal activity nang hindi negatibong nakakaapekto sa paglaki ng mga HeLa cells. Natuklasan din namin na ang mga urmotonic acid derivatives ay nakakagambala sa mga microtubule ng halaman; bilang karagdagan, ang KAND ay nakakaapekto sa mga actin filament at nagdudulot ng pagkamatay ng cell; ang mga multifaceted effect na ito ay naiiba sa mga kilalang microtubule inhibitors at nagmumungkahi ng isang bagong mekanismo ng pagkilos para sa ursonic acid, na kumakatawan sa isang mahalagang bentahe sa pagbuo ng mga bagong herbicide.
Ang pagtuklas at praktikal na aplikasyon ng mga kapaki-pakinabang na natural na produkto at ang kanilang mga hinango ay isang paraan upang mapabuti ang kalidad ng buhay ng tao. Ang mga pangalawang metabolite na ginawa ng mga mikroorganismo, halaman, at insekto ay humantong sa mga pangunahing pagsulong sa medisina at agrikultura. Maraming antibiotic at gamot laban sa leukemia ang nabuo mula sa mga natural na produkto. Bukod pa rito, iba't ibang uri ngmga pestisidyo, ang mga fungicide at herbicide ay kinukuha mula sa mga natural na produktong ito para magamit sa agrikultura. Sa partikular, ang mga herbicide na panlaban sa damo ay mahahalagang kagamitan para sa pagpapataas ng ani ng pananim sa modernong agrikultura, at iba't ibang uri ng compound ang ginagamit na sa komersyo. Maraming proseso ng cellular sa mga halaman, tulad ng photosynthesis, metabolismo ng amino acid, synthesis ng cell wall, regulasyon ng mitosis, phytohormone signaling, o protein synthesis, ay itinuturing na karaniwang target ng mga herbicide. Ang mga compound na pumipigil sa paggana ng microtubule ay isang karaniwang uri ng herbicide na nakakaapekto sa paglaki ng halaman sa pamamagitan ng pag-apekto sa mitotic regulation2.
Ang mga microtubule ay mga bahagi ng cytoskeleton at malawakang naingatan sa mga eukaryotic cell. Ang tubulin heterodimer ay binubuo ng α-tubulin at β-tubulin na bumubuo ng mga linear microtubule protofilament, na may 13 protofilament na bumubuo ng isang cylindrical na istraktura. Ang mga microtubule ay gumaganap ng maraming papel sa mga selula ng halaman, kabilang ang pagtukoy sa hugis ng selula, paghahati ng selula, at intracellular transport3,4. Ang mga selula ng halaman ay naglalaman ng mga microtubule sa ilalim ng interphase plasma membrane, at ang mga tinatawag na cortical microtubule na ito ay pinaniniwalaang kumokontrol sa organisasyon ng mga cellulose microfibril sa pamamagitan ng regulasyon ng mga cellulose synthase complex4,5. Ang mga cortical microtubule ng mga root epidermal cell, na nasa zone ng mabilis na paghaba ng dulo ng ugat, ay matatagpuan sa gilid, at ang mga cellulose microfiber ay sumusunod sa mga microtubule na ito at nililimitahan ang direksyon ng paglawak ng selula, sa gayon ay nagtataguyod ng anisotropic cell elongation. Samakatuwid, ang tungkulin ng microtubule ay malapit na nauugnay sa morpolohiya ng halaman. Ang mga pagpapalit ng amino acid sa mga gene na nagko-code sa tubulin ay nagdudulot ng pagkiling ng mga cortical microtubule array at paglaki sa kaliwa o kanan sa Arabidopsis 6,7. Katulad nito, ang mga mutasyon sa mga protina na nauugnay sa microtubule na nagreregula sa dinamika ng microtubule ay maaari ring humantong sa baluktot na paglaki ng ugat8,9,10,11,12,13. Bukod pa rito, ang paggamot gamit ang mga herbicide na nakakasira sa microtubule tulad ng disopyramide, na kilala rin bilang pretilachlor, ay nagdudulot din ng paglaki ng ugat sa kaliwang bahagi na pahilig14. Ipinapahiwatig ng mga datos na ito na ang tumpak na regulasyon ng tungkulin ng microtubule ay mahalaga para sa pagtukoy ng direksyon ng paglaki ng halaman.
Natuklasan ang iba't ibang uri ng microtubule inhibitors, at ang mga gamot na ito ay nakapagbigay ng malaking kontribusyon sa pananaliksik sa cytoskeletal, gayundin sa agrikultura at medisina2. Sa partikular, ang oryzalin, dinitroaniline compounds, disopyramide, benzamide-related compounds, at ang kanilang mga analogs ay maaaring pumigil sa paggana ng microtubule at sa gayon ay pumigil sa paglaki ng halaman. Samakatuwid, malawakang ginagamit ang mga ito bilang mga herbicide. Gayunpaman, dahil ang mga microtubule ay isang mahalagang bahagi ng mga selula ng halaman at hayop, karamihan sa mga microtubule inhibitor ay cytotoxic sa parehong uri ng selula. Samakatuwid, sa kabila ng kanilang kinikilalang gamit bilang mga herbicide, limitadong bilang ng mga antimicrotubule agent ang ginagamit para sa mga praktikal na layunin.
Ang Streptomyces ay isang genus ng pamilyang Streptomyces, na kinabibilangan ng aerobic, gram-positive, filamentous bacteria at malawak na kilala sa kakayahang makagawa ng malawak na hanay ng mga secondary metabolite. Samakatuwid, ito ay itinuturing na isa sa pinakamahalagang pinagmumulan ng mga bagong biologically active natural na produkto. Sa kasalukuyang pag-aaral, natuklasan namin ang isang bagong compound na tinatawag na coumamonamide, na inihiwalay mula sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 at S. werraensis ISP 5486. Gamit ang spectral analysis at full spectral analysis, nailalarawan ang istruktura ng coumamonamide at natukoy ang natatanging N-alkoxypyrrole skeleton nito. Ang Ursmonic acid, isang synthetic intermediate ng ursmonoamide at mga derivatives nito, ay natagpuang pumipigil sa paglaki at pagtubo ng sikat na modelo ng halaman na Arabidopsis thaliana. Sa isang pag-aaral ng structure-activity relationship, natuklasan namin na ang isang compound na may C9 na binago sa ursonic acid, na tinatawag na nonyloxy derivative ng ursonic acid (KAND), ay makabuluhang nagpapahusay sa inhibitory effect sa paglaki at pagtubo. Kapansin-pansin, ang bagong natuklasang plant growth inhibitor ay nakaapekto rin sa paglaki ng tabako at liverwort at hindi cytotoxic sa bacteria o HeLa cells. Bukod dito, ang ilang urmotonic acid derivatives ay nagdudulot ng distorted root phenotype, na nagpapahiwatig na ang mga derivatives na ito ay direkta o hindi direktang nakakaapekto sa mga microtubule. Alinsunod sa ideyang ito, ang aming mga obserbasyon sa mga microtubule na may label na immunohistochemically o fluorescent proteins ay nagpapahiwatig na ang paggamot ng KAND ay nagde-depolymerize ng mga microtubule. Bukod pa rito, ang paggamot gamit ang mga kumamotonic acid derivatives ay nakagambala sa mga actin microfilament. Kaya, natuklasan namin ang isang bagong plant growth inhibitor na ang natatanging mekanismo ng pagkilos ay kinabibilangan ng pagkasira ng cytoskeleton.
Ang strain na MK493-CF1 ay inihiwalay mula sa lupa sa Shinagawa-ku, Tokyo. Ang strain na MK493-CF1 ay bumuo ng well-branched stromal mycelium. Natukoy ang partial sequence ng 16S ribosomal RNA gene (1422 bp). Ang strain na ito ay halos kapareho ng S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipikal na strain, 99.93%). Batay sa resultang ito, natukoy na ang strain na ito ay malapit na nauugnay sa uri ng strain ng S. werraensis. Samakatuwid, pansamantala naming pinangalanan ang strain na ito na S. werraensis MK493-CF1. Ang S. werraensis ISP 5486T ay gumagawa rin ng parehong bioactive compounds. Dahil kakaunti ang maagang pananaliksik sa pagkuha ng mga natural na produkto mula sa microorganism na ito, isinagawa ang karagdagang pananaliksik sa kemikal. Matapos ang paglilinang ng S. werraensis MK493-CF1 sa barley medium sa pamamagitan ng solid-state fermentation sa 30°C sa loob ng 14 na araw, ang medium ay kinuha gamit ang 50% EtOH. 60 ml ng sample ang pinatuyo upang makakuha ng 59.5 mg ng crude extract. Ang crude extract ay isinailalim sa reverse phase HPLC upang makakuha ng N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, na pinangalanang coumamonamide, 36.0 mg). Ang kabuuang dami ng 1 ay humigit-kumulang 60% ng crude extract. Samakatuwid, napagpasyahan naming pag-aralan nang detalyado ang mga katangian ng kumamotoamide 1.
Ang Coumamonamide 1 ay isang puting amorphous na pulbos at kinumpirma ng high resolution mass spectrometry (HRESIMS) ang C6H8N2O2 (Fig. 1). Ang C2-substituted pyrrole fragment ng compound na ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH sa 1H NMR spectrum: 4.5 Hz, H-5) at δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), at ang 13C NMR spectrum ay nagpapakita ng presensya ng apat na sp2 carbon atoms. Ang presensya ng isang amide group sa posisyon ng C2 ay tinasa sa pamamagitan ng HMBC correlation mula sa C-3 proton patungo sa amide carbonyl carbon sa δC 161.1. Bukod pa rito, ang 1 H at 13 C NMR peaks sa δH 4.10 (3H, S) at δC 68.3 ay nagpapahiwatig ng presensya ng mga N-methoxy group sa molekula. Bagama't ang tamang posisyon ng methoxy group ay hindi pa natutukoy gamit ang spectroscopic analysis tulad ng enhanced difference spectroscopy at nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), ang N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ang naging unang kandidatong compound.
Upang matukoy ang tamang istruktura ng 1, isang kabuuang sintesis ang isinagawa (Larawan 2a). Ang paggamot sa komersyal na makukuhang 2-aminopyridine 2 gamit ang m-CPBA ay nagresulta sa katumbas na N-oxide 3 sa dami ng ani. Pagkatapos ng 2-aminoazidation ng 2, ang reaksyon ng cyclocondensation na inilarawan ni Abramovich ay isinagawa sa benzene sa 90°C upang makuha ang ninanais na 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 sa gramo. Bilis 60% (dalawang yugto). 15,16. Ang methylation at hydrolysis ng 4 ay nagbigay ng 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (tinatawag na "cumotonic acid", 6) sa mahusay na ani (70%, dalawang hakbang). Panghuli, ang amidation sa pamamagitan ng acid chloride intermediate 6 gamit ang aqueous ammonia ay nagbigay sa Kumamoto amide 1 sa 98% na ani. Ang lahat ng spectral data ng na-synthesize na 1 ay katulad ng nakahiwalay na 1, kaya ang istruktura ng 1 ay natukoy;
Pangkalahatang sintesis at pagsusuri ng biyolohikal na aktibidad ng urbenamide at urbenic acid. (a) Kabuuang sintesis ng Kumamoto amide. (b) Ang pitong-araw na gulang na wild-type na Arabidopsis Columbia (Col) na mga punla ay itinanim sa mga plato ng Murashige at Skoog (MS) na naglalaman ng coumamonamide 6 o coumamonamide 1 sa ipinahiwatig na konsentrasyon. Scale bar = 1 cm.
Una, sinuri namin ang mga biyolohikal na aktibidad ng urbenamide at mga intermediate nito para sa kanilang kakayahang baguhin ang paglaki ng halaman. Nagdagdag kami ng iba't ibang konsentrasyon ng ursmonamide 1 o ursmonic acid 6 sa MS agar medium at kinultura ang mga punla ng Arabidopsis thaliana sa medium na ito. Ipinakita ng mga assay na ito na ang mataas na konsentrasyon (500 μM) ng 6 ay pumigil sa paglaki ng ugat (Fig. 2b). Susunod, bumuo kami ng iba't ibang derivatives sa pamamagitan ng pagpapalit sa posisyon ng N1 na 6 at nagsagawa ng mga pag-aaral ng ugnayan ng istruktura-aktibidad sa mga ito (ang proseso ng analogue synthesis ay inilarawan sa Supporting Information (SI)). Ang mga punla ng Arabidopsis ay itinanim sa isang medium na naglalaman ng 50 μM ursonic acid derivatives, at sinukat ang haba ng ugat tulad ng ipinapakita sa larawan. Tulad ng ipinapakita sa Figures 3a, b, at S1, ang mga coumamo acid ay may iba't ibang haba ng linear alkoxy chains (9, 10, 11, 12, at 13) o malalaking alkoxy chains (15, 16, at 17) sa posisyon ng N1. Ang mga derivatives ay nagpakita ng makabuluhang pagpigil sa paglaki ng ugat. Bukod pa rito, natuklasan namin na ang paglalagay ng 200 μM 10, 11, o 17 ay pumigil sa pagtubo (Mga Larawan 3c at S2).
Pag-aaral ng ugnayan ng istruktura-aktibidad ng Kumamoto amide at mga kaugnay na compound. (a) Iskema ng istruktura at sintesis ng mga analogue. (b) Pagkuwantipika ng haba ng ugat ng 7-araw na gulang na mga punla na itinanim sa MS medium na mayroon o walang 50 μM coumamonamide derivatives. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (t test, p< 0.05). n>18. Ang datos ay ipinapakita bilang mean ± SD. Ang nt ay nangangahulugang "hindi nasubukan" dahil mahigit sa 50% ng mga buto ang hindi sumibol. (c) Pagkuwantipika ng bilis ng pagtubo ng mga ginamot na buto na in-incubate sa loob ng 7 araw sa MS medium na mayroon o walang 200 μM coumamonamide at mga kaugnay na compound. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (chi-square test). n=96.
Kapansin-pansin, ang pagdaragdag ng mga alkyl side chain na mas mahaba kaysa sa C9 ay nagbawas sa aktibidad ng pagpigil, na nagmumungkahi na ang mga compound na nauugnay sa kumamotoic acid ay nangangailangan ng mga side chain na may tiyak na laki upang maipakita ang kanilang biyolohikal na aktibidad.
Dahil ipinakita ng pagsusuri ng ugnayan sa istruktura-aktibidad na ang C9 ay binago sa ursonic acid at ang nonyloxy derivative ng ursonic acid (mula rito ay tatawaging KAND 11) ang pinakamabisang inhibitor ng paglago ng halaman, nagsagawa kami ng mas detalyadong paglalarawan ng KAND 11. Ang paggamot sa Arabidopsis gamit ang 50 μM KAND 11 ay halos ganap na pumigil sa pagtubo, samantalang ang mas mababang konsentrasyon (40, 30, 20, o 10 μM) ng KAND 11 ay pumigil sa paglaki ng ugat sa paraang dose-dependent (Fig. 4a, b). Upang masubukan kung nakakaapekto ang KAND 11 sa viability ng meristem ng ugat, sinuri namin ang mga meristem ng ugat na binahiran ng propidium iodide (PI) at sinukat ang laki ng meristem area. Ang laki ng meristem ng mga punla na lumaki sa isang medium na naglalaman ng 25 μM KAND-11 ay 151.1 ± 32.5 μm, habang ang laki ng meristem ng mga punla na lumaki sa isang control medium na naglalaman ng DMSO ay 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), na nagpapahiwatig na ang KAND-11 ay nagpapanumbalik ng aktibidad ng selula. pagkalat. Root meristem. Kasabay nito, binawasan ng paggamot ng KAND 11 ang dami ng cell division marker na CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signal sa root meristem (Fig. 4e) 17. Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na pinipigilan ng KAND 11 ang paglaki ng ugat sa pamamagitan ng pagbabawas ng aktibidad ng paglaganap ng selula.
Pagsusuri ng epekto ng pagpigil ng mga urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) sa paglaki. (a) 7-araw na gulang na wild-type na mga punla ng Col na itinanim sa mga MS plate na may ipinahiwatig na konsentrasyon ng KAND 11. Scale bar = 1 cm. (b) Pagkuwantipika ng haba ng ugat. Ang mga letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba (Tukey HSD test, p< 0.05). n>16. Ang datos ay ipinapakita bilang mean ± SD. (c) Confocal microscopy ng mga ugat na may propidium iodide-stained wild-type Col na lumaki sa mga MS plate na mayroon o walang 25 μM KAND 11. Ang mga puting bracket ay nagpapahiwatig ng root meristem. Scale bar = 100 µm. (d) Pagkuwantipika ng laki ng root meristem (n = 10 hanggang 11). Ang mga istatistikal na pagkakaiba ay natukoy gamit ang t-test (p< 0.05). Ang mga bar ay kumakatawan sa karaniwang laki ng meristem. (e) Differential interference contrast (DIC) microscopy ng isang root meristem na naglalaman ng CDKB2 construct; 1pro: CDKB2; 1-GUS na kinulayan at kinulayan sa 5-araw na gulang na mga punla na itinanim sa MS plates na mayroon o walang 25 µM KAND assay.
Ang phytotoxicity ng KAND 11 ay sinubukan pa gamit ang isa pang dicotyledonous na halaman, ang tabako (Nicotiana tabacum), at isang pangunahing modelo ng organismo ng halaman sa lupa, ang liverwort (Marchantia polymorpha). Tulad ng sa kaso ng Arabidopsis, ang mga punla ng tabako SR-1 na itinanim sa medium na naglalaman ng 25 μM KAND 11 ay nagbunga ng mas maiikling ugat (Fig. 5a). Bukod pa rito, 40 sa 48 na buto ang tumubo sa mga plato na naglalaman ng 200 μM KAND 11, samantalang ang lahat ng 48 na buto ay tumubo sa mock-treated media, na nagpapahiwatig na ang mas mataas na konsentrasyon ng KAND ay makabuluhan (p< 0.05; chi test -square) ay pumigil sa pagtubo ng tabako. (Fig. 5b). Bukod pa rito, ang konsentrasyon ng KAND 11 na pumigil sa paglaki ng bacteria sa liverwort ay katulad ng epektibong konsentrasyon sa Arabidopsis (Fig. 5c). Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na maaaring pigilan ng KAND 11 ang paglaki ng iba't ibang halaman. Pagkatapos ay sinuri namin ang posibleng cytotoxicity ng mga compound na nauugnay sa bear monoamide sa iba pang mga organismo, katulad ng mga selula ng HeLa ng tao at Escherichia coli strain DH5α, bilang mga kinatawan ng mas mataas na selula ng hayop at bacterial, ayon sa pagkakabanggit. Sa isang serye ng mga cell proliferation assay, naobserbahan namin na ang coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, at KAND 11 ay hindi nakakaapekto sa paglaki ng mga selula ng HeLa o E. coli sa mga konsentrasyon na 100 μM (Fig. 5d,e).
Pagpigil sa paglago ng KAND 11 sa mga organismong hindi Arabidopsis. (a) Ang mga dalawang-linggong gulang na wild-type SR-1 na punla ng tabako ay itinanim sa mga patayong nakaposisyon na MS plate na naglalaman ng 25 μM KAND 11. (b) Ang mga dalawang-linggong gulang na wild-type SR-1 na punla ng tabako ay itinanim sa mga pahalang na nakaposisyon na MS plate na naglalaman ng 200 μM KAND 11. (c) Ang mga dalawang-linggong gulang na wild-type Tak-1 liverwort buds na itinanim sa mga Gamborg B5 plate na may ipinahiwatig na konsentrasyon ng KAND 11. Ang mga pulang palaso ay nagpapahiwatig ng mga spore na tumigil sa paglaki sa loob ng dalawang-linggong panahon ng inkubasyon. (d) Pagsusuri sa paglaganap ng selula ng mga selula ng HeLa. Ang bilang ng mga mabubuhay na selula ay sinukat sa mga takdang agwat ng oras gamit ang isang cell counting kit 8 (Dojindo). Bilang isang kontrol, ang mga selula ng HeLa ay ginamot gamit ang 5 μg/ml actinomycin D (Act D), na pumipigil sa transkripsyon ng RNA polymerase at nagiging sanhi ng pagkamatay ng selula. Ang mga pagsusuri ay isinagawa nang tatlong beses. (e) Pagsusuri sa paglaganap ng selula ng E. coli. Ang paglaki ng E. coli ay sinuri sa pamamagitan ng pagsukat ng OD600. Bilang kontrol, ang mga selula ay ginamot gamit ang 50 μg/ml ampicillin (Amp), na pumipigil sa sintesis ng bacterial cell wall. Ang mga pagsusuri ay isinagawa nang tatlong beses.
Upang maunawaan ang mekanismo ng pagkilos ng cytotoxicity na dulot ng mga compound na may kaugnayan sa uramide, muling sinuri namin ang mga urbenic acid derivatives na may katamtamang inhibitory effect, gaya ng ipinapakita sa larawan. Gaya ng ipinapakita sa Figures 2b, 6a, ang mga punla na itinanim sa mga agar plate na naglalaman ng mataas na konsentrasyon (200 μM) ng urmotonic acid 6 ay nagbunga ng mas maikli at kaliwang kurbadong mga ugat (θ = – 23.7 ± 6.1), samantalang sa mga punla na itinanim sa control medium, ang mga punla ay nagbunga ng halos tuwid na mga ugat (θ = – 3.8 ± 7.1). Ang katangiang pahilig na paglaki na ito ay alam na resulta ng dysfunction ng cortical microtubule14,18. Alinsunod sa natuklasang ito, ang mga microtubule-destabilizing na gamot na disopyramide at oryzalin ay nagdulot ng katulad na pagkiling ng ugat sa ilalim ng aming mga kondisyon ng paglaki (Figs. 2b, 6a). Kasabay nito, sinubukan namin ang mga urmotonic acid derivatives at pumili ng ilan sa mga ito na, sa ilang partikular na konsentrasyon, ay nagdulot ng pahilig na paglaki ng ugat. Binago ng mga compound 8, 9, at 15 ang direksyon ng paglaki ng ugat sa 75 μM, 50 μM, at 40 μM, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapahiwatig na ang mga compound na ito ay maaaring epektibong magpawalang-bisa sa mga microtubule (Fig. 2b, 6a). Sinubukan din namin ang pinakamalakas na ursolic acid derivative, ang KAND 11, sa mas mababang konsentrasyon (15 µM) at natuklasan na ang paglalapat ng KAND 11 ay pumigil sa paglaki ng ugat at ang direksyon ng paglaki ng ugat ay hindi pantay, bagama't may posibilidad silang humilig pakaliwa (Figure C3). Dahil ang mas mataas na konsentrasyon ng mga gamot na nagpapawalang-bisa sa microtubule ay minsan pumipigil sa paglaki ng halaman sa halip na maging sanhi ng pagkiling ng ugat, sinuri namin ang posibilidad na ang KAND 11 ay nakakaapekto sa mga microtubule sa pamamagitan ng pag-obserba sa mga cortical microtubule sa mga root epidermal cell. Ang immunohistochemistry gamit ang mga anti-β-tubulin antibodies sa mga epidermal cell ng mga ugat ng punla na ginagamot ng 25 μM KAND 11 ay nagpakita ng pagkawala ng halos lahat ng cortical microtubule sa mga epidermal cell sa elongation zone (Fig. 6b). Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang kumamotonic acid at ang mga derivatives nito ay direktang o hindi direktang kumikilos sa mga microtubule upang guluhin ang mga ito at ang mga compound na ito ay mga nobelang microtubule inhibitor.
Binabago ng Ursonic acid at ng mga derivatives nito ang cortical microtubule sa Arabidopsis thaliana. (a) Anggulo ng pagkahilig ng ugat na sinukat sa presensya ng iba't ibang urmotonic acid derivatives sa ipinahiwatig na konsentrasyon. Sinuri rin ang mga epekto ng dalawang compound na kilalang pumipigil sa mga microtubule: disopyramide at oryzalin. Ipinapakita ng inset ang pamantayang ginagamit upang sukatin ang anggulo ng paglaki ng ugat. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (t test, p< 0.05). n>19. Scale bar = 1 cm. (b) Mga cortical microtubule sa mga epidermal cell sa elongation zone. Ang mga microtubule sa wild-type na Arabidopsis Col na mga ugat na lumaki sa mga MS plate na mayroon o walang 25 μM KAND 11 ay nakita sa pamamagitan ng immunohistochemical staining gamit ang β-tubulin primary antibodies at Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies. Scale bar = 10 µm. (c) Mitotic na istruktura ng mga microtubule sa root meristem. Ang mga microtubule ay nakita sa pamamagitan ng immunohistochemical staining. Ang mga mitotic na istruktura, kabilang ang mga prophase zone, spindle, at phragmoplast, ay binilang mula sa mga confocal na imahe. Ang mga arrow ay nagpapahiwatig ng mga mitotic na istruktura ng microtubule. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa sham treatment (t test, p< 0.05). n>9. Iskalang baras = 50 µm.
Bagama't may kakayahang guluhin ng Ursa ang tungkulin ng microtubule, inaasahang magiging iba ang mekanismo ng pagkilos nito kumpara sa mga tipikal na microtubule depolymerizing agents. Halimbawa, ang mas mataas na konsentrasyon ng mga microtubule depolymerizing agents tulad ng disopyramide at oryzalin ay nagdudulot ng anisotropic expansion ng mga epidermal cells, samantalang ang KAND 11 ay hindi. Bukod pa rito, ang sabay na paggamit ng KAND 11 at disopyramide ay nagresulta sa pinagsamang tugon sa paglaki ng ugat na dulot ng disopyramide at naobserbahan ang pagpigil sa paglaki na dulot ng KAND 11 (Fig. S4). Sinuri rin namin ang tugon ng hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant sa KAND 11. Ang phs1-1 ay may non-canonical tubulin kinase point mutation at nagbubunga ng mas maiikling ugat kapag ginamot gamit ang disopyramide9,20. Ang mga phs1-1 mutant seedlings na lumaki sa agar medium na naglalaman ng KAND 11 ay may mas maiikling ugat na katulad ng mga lumaki sa disopyramid (fig. S5).
Bukod pa rito, naobserbahan namin ang mga istruktura ng mitotic microtubule, tulad ng mga prophase zone, spindle, at phragmoplast, sa root meristem ng mga punla na ginamitan ng KAND 11. Alinsunod sa mga obserbasyon para sa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, isang makabuluhang pagbaba sa bilang ng mga mitotic microtubule ang naobserbahan (Fig. .6c).
Upang makilala ang cytotoxicity ng KAND 11 sa subcellular resolution, ginamit namin ang KAND 11 sa paggamit ng tobacco BY-2 suspension cells at inobserbahan ang kanilang tugon. Una naming idinagdag ang KAND 11 sa mga BY-2 cells na nagpapahayag ng TagRFP-TUA6, na fluorescently na naglalagay ng label sa mga microtubule, upang masuri ang epekto ng KAND 11 sa mga cortical microtubule. Ang cortical microtubule density ay tinasa gamit ang image analysis, na tinantiya ang porsyento ng mga cytoskeletal pixel sa mga cytoplasmic pixel. Ipinakita ng mga resulta ng assay na pagkatapos ng paggamot gamit ang 50 μM o 100 μM KAND 11 sa loob ng 1 oras, ang density ay bumaba nang malaki sa 0.94 ± 0.74% o 0.23 ± 0.28%, ayon sa pagkakabanggit, habang ang density ng mga cells na ginamitan ng DMSO ay umabot sa 1.61 ± 0.34% (Fig. 7a). Ang mga resultang ito ay naaayon sa obserbasyon sa Arabidopsis na ang paggamot gamit ang KAND 11 ay nagdudulot ng depolymerization ng mga cortical microtubule (Fig. 6b). Sinuri rin namin ang linya ng BY-2 gamit ang mga filament ng actin na may label na GFP-ABD pagkatapos ng paggamot na may parehong konsentrasyon ng KAND 11 at naobserbahan na ang paggamot gamit ang KAND 11 ay nakagambala sa mga filament ng actin. Ang paggamot gamit ang 50 μM o 100 μM KAND 11 sa loob ng 1 oras ay makabuluhang nagpababa sa densidad ng actin filament sa 1.20 ± 0.62% o 0.61 ± 0.26%, ayon sa pagkakabanggit, samantalang ang densidad sa mga selulang ginagamot ng DMSO ay 1.69 ± 0.51% (Larawan 2). 7b). Ang mga resultang ito ay kabaligtaran ng mga epekto ng propyzamide, na hindi nakakaapekto sa mga filament ng actin, at latrunculin B, isang actin depolymerizer na hindi nakakaapekto sa mga microtubule (SI Figure S6). Bilang karagdagan, ang paggamot gamit ang coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, o KAND 11 ay hindi nakakaapekto sa mga microtubule sa mga selula ng HeLa (SI Figure S7). Kaya naman, ang mekanismo ng pagkilos ng KAND 11 ay pinaniniwalaang naiiba sa mga kilalang cytoskeleton disruptors. Bukod pa rito, ang aming mikroskopikong obserbasyon sa mga selulang BY-2 na ginamot gamit ang KAND 11 ay nagsiwalat ng pagsisimula ng pagkamatay ng selula habang ginagamot ang KAND 11 at ipinakita na ang proporsyon ng mga patay na selulang may kulay asul na Evans ay hindi tumaas nang malaki pagkatapos ng 30 minuto ng paggamot gamit ang KAND 11, samantalang pagkatapos ng 90 minuto ng paggamot gamit ang 50 μM o 100 μM KAND, ang bilang ng mga patay na selula ay tumaas sa 43.7% o 80.1%, ayon sa pagkakabanggit (Fig. 7c). Kung pagsasama-samahin, ipinapahiwatig ng mga datos na ito na ang nobelang ursolic acid derivative na KAND 11 ay isang plant-specific cytoskeletal inhibitor na may dating hindi kilalang mekanismo ng pagkilos.
Ang KAND ay nakakaapekto sa mga cortical microtubule, actin filament, at viability ng mga BY-2 cell ng tabako. (a) Pagpapakita ng mga cortical microtubule sa mga BY-2 cell sa presensya ng TagRFP-TUA6. Ang mga BY-2 cell na ginamitan ng KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO ay sinuri gamit ang confocal microscopy. Ang cortical microtubule density ay kinalkula mula sa mga micrograph ng 25 independent cell. Ang mga letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba (Tukey HSD test, p< 0.05). Scale bar = 10 µm. (b) Mga cortical actin filament sa mga BY-2 cell na nakita sa presensya ng GFP-ABD2. Ang mga BY-2 cell na ginamitan ng KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO ay sinuri gamit ang confocal microscopy. Ang densidad ng mga cortical actin filament ay kinalkula mula sa mga micrograph ng 25 independent cell. Ang mga letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba (Tukey HSD test, p< 0.05). Scale bar = 10 µm. (c) Obserbasyon ng mga patay na selula ng BY-2 sa pamamagitan ng Evans blue staining. Ang mga selula ng BY-2 na ginamitan ng KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO ay sinuri gamit ang bright-field microscopy. n=3. Scale bar = 100 µm.
Ang pagtuklas at paggamit ng mga bagong natural na produkto ay humantong sa mga makabuluhang pagsulong sa iba't ibang aspeto ng buhay ng tao, kabilang ang medisina at agrikultura. Isinagawa ang mga makasaysayang pananaliksik upang makakuha ng mga kapaki-pakinabang na compound mula sa mga likas na yaman. Sa partikular, ang mga actinomycetes ay kilalang kapaki-pakinabang bilang mga antiparasitic antibiotic para sa mga nematode dahil sa kanilang kakayahang gumawa ng iba't ibang pangalawang metabolite tulad ng avermectin, ang pangunahing compound ng ivermectin at bleomycin at mga derivatives nito, na ginagamit sa medisina bilang isang anticancer agent21,22. Gayundin, iba't ibang mga herbicidal compound ang natuklasan mula sa mga actinomycetes, na ang ilan ay ginagamit na sa komersyo1,23. Samakatuwid, ang pagsusuri ng mga metabolite ng actinomycete upang ihiwalay ang mga natural na produkto na may ninanais na biological activity ay itinuturing na isang epektibong estratehiya. Sa pag-aaral na ito, natuklasan namin ang isang bagong compound, ang coumamonamide, mula sa S. werraensis at matagumpay itong na-synthesize. Ang Ursonic acid ay isang sintetikong intermediate ng urbenamide at mga derivatives nito. Maaari itong magdulot ng katangiang pagkulot ng ugat, magpakita ng katamtaman hanggang malakas na herbicidal activity, at direkta o hindi direktang makapinsala sa mga microtubule ng halaman. Gayunpaman, ang mekanismo ng pagkilos ng urmotonic acid ay maaaring naiiba sa mga umiiral na microtubule inhibitor, dahil ang KAND 11 ay sumisira rin sa mga actin filament at nagdudulot ng pagkamatay ng cell, na nagmumungkahi ng isang mekanismo ng regulasyon kung saan ang urmotonic acid at mga derivatives nito ay nakakaimpluwensya sa isang malawak na hanay ng mga istrukturang cytoskeletal.
Ang mas detalyadong paglalarawan ng urbenonic acid ay makakatulong upang mas maunawaan ang mekanismo ng pagkilos ng urbenonic acid. Sa partikular, ang susunod na layunin ay suriin ang kakayahan ng ursonic acid na magbigkis sa mga nabawasang microtubule upang matukoy kung ang ursonic acid at ang mga derivatives nito ay direktang kumikilos sa mga microtubule at i-depolymerize ang mga ito, o kung ang kanilang pagkilos ay nagreresulta sa destabilization ng microtubule. Bilang karagdagan, sa kaso kung saan ang mga microtubule ay hindi direktang target, ang pagtukoy sa lugar ng pagkilos at mga molekular na target ng ursonic acid sa mga selula ng halaman ay makakatulong na higit na maunawaan ang mga katangian ng mga kaugnay na compound at mga posibleng paraan upang mapabuti ang aktibidad ng herbicidal. Ipinakita ng aming bioactivity assay ang natatanging cytotoxic na kakayahan ng ursonic acid sa paglaki ng mga halaman tulad ng Arabidopsis thaliana, tabako at liverwort, habang hindi naapektuhan ang mga E. coli o HeLa cell. Ang kaunti o walang toxicity sa mga selula ng hayop ay isang bentahe ng mga ursonic acid derivatives kung ang mga ito ay binuo bilang mga herbicide para gamitin sa mga bukas na bukid ng agrikultura. Sa katunayan, dahil ang mga microtubule ay karaniwang mga istruktura sa mga eukaryote, ang kanilang pumipiling pagsugpo sa mga halaman ay isang pangunahing kinakailangan para sa mga herbicide. Halimbawa, ang propyzamide, isang microtubule depolymerizing agent na direktang nagbibigkis sa tubulin at pumipigil sa polimerisasyon, ay ginagamit bilang herbicide dahil sa mababang toxicity nito sa mga selula ng hayop24. Kabaligtaran ng disopyramide, ang mga kaugnay na benzamide ay may iba't ibang target specificity. Bukod sa mga microtubule ng halaman, ang RH-4032 o benzoxamide ay pumipigil din sa mga microtubule ng mga selula ng hayop o oomycetes, ayon sa pagkakabanggit, at ang zalilamide ay ginagamit bilang fungicide dahil sa mababang phytotoxicity nito25,26,27. Ang bagong natuklasang oso at ang mga derivatives nito ay nagpapakita ng selective cytotoxicity laban sa mga halaman, ngunit mahalagang tandaan na ang mga karagdagang pagbabago ay maaaring magpabago sa kanilang target specificity, na posibleng magbigay ng karagdagang mga derivatives para sa pagkontrol ng mga pathogenic fungi o oomycetes.
Ang mga natatanging katangian ng urbenonic acid at mga derivatives nito ay kapaki-pakinabang para sa kanilang pag-unlad bilang mga herbicide at paggamit bilang mga kagamitan sa pananaliksik. Malawakang kinikilala ang kahalagahan ng cytoskeleton sa pagkontrol sa hugis ng selula ng halaman. Ipinakita ng mga naunang pag-aaral na ang mga halaman ay nakapag-ebolusyon ng mga kumplikadong mekanismo ng organisasyon ng cortical microtubule sa pamamagitan ng pagkontrol sa dinamika ng microtubule upang maayos na makontrol ang morphogenesis. Malaking bilang ng mga molekula na responsable para sa regulasyon ng aktibidad ng microtubule ang natukoy, at ang mga kaugnay na pananaliksik ay patuloy pa rin3,4,28. Ang ating kasalukuyang pag-unawa sa dinamika ng microtubule sa mga selula ng halaman ay hindi lubos na nagpapaliwanag ng mga mekanismo ng organisasyon ng cortical microtubule. Halimbawa, bagama't ang parehong disopyramide at oryzalin ay maaaring mag-depolymerize ng mga microtubule, ang disopyramide ay nagdudulot ng matinding pagbaluktot ng ugat habang ang oryzalin ay may medyo banayad na epekto. Bukod dito, ang mga mutasyon sa tubulin, na nagpapatatag sa mga microtubule, ay nagdudulot din ng dextrorotation sa mga ugat, samantalang ang paclitaxel, na nagpapatatag din sa dinamika ng microtubule, ay hindi. Samakatuwid, ang pag-aaral at pagtukoy sa mga molekular na target ng ursolic acid ay dapat magbigay ng mga bagong pananaw sa regulasyon ng mga cortical microtubule ng halaman. Gayundin, ang mga paghahambing sa hinaharap ng mga kemikal na epektibo sa pagtataguyod ng baluktot na paglaki, tulad ng disopyramide, at mga hindi gaanong epektibong kemikal, tulad ng oryzalin o kumamotoric acid, ay magbibigay ng mga pahiwatig kung paano nangyayari ang baluktot na paglaki.
Sa kabilang banda, ang mga cytoskeletal rearrangement na may kaugnayan sa depensa ay isa pang posibilidad na ipaliwanag ang cytotoxicity ng ursonic acid. Ang impeksyon ng isang pathogen o pagpapakilala ng isang elicitor sa mga selula ng halaman ay minsan nagdudulot ng pagkasira ng cytoskeleton at kasunod na pagkamatay ng cell29. Halimbawa, ang cryptoxanthin na nagmula sa oomycete ay naiulat na nakakagambala sa mga microtubule at actin filament bago ang pagkamatay ng cell ng tabako, katulad ng nangyayari sa paggamot ng KAND30,31. Ang mga pagkakatulad sa pagitan ng mga tugon sa depensa at mga tugon sa cellular na dulot ng ursonic acid ay humantong sa amin na mag-hypothesize na nagti-trigger ang mga ito ng mga karaniwang proseso ng cellular, bagaman ang isang mas mabilis at mas malakas na epekto ng ursonic acid kaysa sa cryptoxanthin ay maliwanag. Gayunpaman, ipinakita ng mga pag-aaral na ang pagkagambala ng mga actin filament ay nagtataguyod ng kusang pagkamatay ng cell, na hindi palaging sinasamahan ng pagkagambala ng microtubule29. Bilang karagdagan, kailangan pang makita kung ang pathogen o elicitor ay nagdudulot ng baluktot na paglaki ng ugat, tulad ng ginagawa ng mga ursonic acid derivatives. Samakatuwid, ang kaalaman sa molekular na nag-uugnay sa mga tugon sa depensa at ang cytoskeleton ay isang kaakit-akit na problema na dapat tugunan. Sa pamamagitan ng pagsasamantala sa presensya ng mga low molecular weight compound na may kaugnayan sa ursonic acid, pati na rin ang iba't ibang derivatives na may iba't ibang potensyal, maaari silang magbigay ng mga pagkakataon upang i-target ang mga hindi kilalang mekanismo ng cellular.
Kung pagsasama-samahin, ang pagtuklas at paggamit ng mga bagong compound na nagmo-modulate sa dinamika ng microtubule ay magbibigay ng makapangyarihang mga pamamaraan upang matugunan ang mga kumplikadong mekanismo ng molekula na pinagbabatayan ng pagtukoy ng hugis ng selula ng halaman. Sa kontekstong ito, ang kamakailang nabuong compound na urmotonic acid, na nakakaapekto sa mga microtubule at actin filament at nagdudulot ng pagkamatay ng selula, ay maaaring magbigay ng pagkakataon upang maunawaan ang koneksyon sa pagitan ng pagkontrol ng microtubule at ng iba pang mga mekanismong ito. Kaya, ang kemikal at biyolohikal na pagsusuri gamit ang urbenonic acid ay makakatulong sa atin na maunawaan ang mga mekanismo ng regulasyon ng molekula na kumokontrol sa cytoskeleton ng halaman.
Itanim ang S. werraensis MK493-CF1 sa isang 500 mL na baffled Erlenmeyer flask na naglalaman ng 110 mL ng seed medium na binubuo ng 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto composition.-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) corn extract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 at 0.2% CaCO3 sa deionized water. (pH 7.4 bago isterilisasyon). Ang mga seed culture ay in-incubate sa isang rotary shaker (180 rpm) sa 27°C sa loob ng 2 araw. Ang produksyon ng cultivation ay sa pamamagitan ng solid state fermentation. Ang kultura ng binhi (7 ml) ay inilipat sa isang 500 ml na K-1 flask na naglalaman ng 40 g ng production medium na binubuo ng 15 g ng pressed barley (MUSO Co., Ltd., Japan) at 25 g ng deionized water (ang pH ay hindi inayos bago ang isterilisasyon). Ang fermentation ay isinagawa sa 30°C sa dilim sa loob ng 14 na araw. Ang fermentation material ay kinuha gamit ang 40 ml/bote ng EtOH at sinentripuga (1500 g, 4°C, 10 min). Ang culture supernatant (60 ml) ay kinuha gamit ang pinaghalong 10% MeOH/EtOAc. Ang organikong patong ay pinasingaw sa ilalim ng pinababang presyon upang makakuha ng residue (59.5 mg), na isinailalim sa HPLC na may gradient elution (0–10 minuto: 90%) sa isang reverse phase column (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × haba 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuto: 90% H2O/CH3CN hanggang 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuto: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuto: 90% H2O/EtOH hanggang 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) sa flow rate na 1.5 ml/min, ang coumamonamide (1, 36.0 mg) ay inihiwalay bilang isang puting amorphous powder.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkuladong halaga: 141.0659, nasukat na halaga: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Ang mga buto ng Columbia (Col-0) ay nakuha mula sa Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) na may pahintulot para sa paggamit sa pananaliksik. Ang mga buto ng Col-0 ay pinarami at pinanatili sa ilalim ng aming mga kondisyon sa laboratoryo at ginamit bilang mga halamang Arabidopsis na ligaw ang uri. Ang mga buto ng Arabidopsis ay isterilisado sa ibabaw at kinultura sa kalahating lakas na medium na Murashige at Skoog na naglalaman ng 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) at 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, sa 23 °C at palaging liwanag. Ang mga buto ng phs1-1 mutant ay ibinigay ni T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ang mga buto ng strain SR-1 ay ibinigay ng T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) at ginamit bilang mga wild-type na halaman ng tabako. Ang mga buto ng tabako ay isterilisado sa ibabaw at ibinabad sa isterilisadong tubig sa loob ng tatlong gabi upang mapabilis ang pagtubo, pagkatapos ay inilagay sa isang kalahating lakas na solusyon na naglalaman ng 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, at 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. at Skoog medium) na may pH 5.7 at in-incubate sa 23°C sa ilalim ng palaging liwanag.
Ang Strain Tak-1 ay ibinigay ng T. Kohchi (Kyoto University) at ginamit bilang pamantayang experimental unit para sa pag-aaral ng liverwort. Ang Gemma ay nakuha mula sa mga isterilisadong cultured na halaman at pagkatapos ay inilagay sa Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) na naglalaman ng 1% sucrose at 0.3% gellan gum at in-incubate sa 23°C sa ilalim ng tuloy-tuloy na liwanag.
Ang mga selula ng Tobacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ay ibinigay ni S. Hasezawa (University of Tokyo). Ang mga selula ng BY-2 ay diluted nang 95 beses sa binagong Linsmeier at Skoog medium at nilagyan ng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 linggu-linggo. Ang suspensyon ng selula ay hinalo sa isang rotary shaker sa 130 rpm sa 27°C sa dilim. Hugasan ang mga selula gamit ang 10 beses na dami ng sariwang medium at muling i-suspend sa parehong medium. Ang mga transgenic cell lines ng BY-2 na matatag na nagpapahayag ng microtubule marker na TagRFP-TUA6 o ng actin filament marker na GFP-ABD2 sa ilalim ng cauliflower mosaic virus 35S promoter ay nabuo gaya ng inilarawan 33,34,35. Ang mga cell lines na ito ay maaaring mapanatili at i-synchronize gamit ang mga pamamaraang katulad ng mga ginamit para sa orihinal na BY-2 cell line.
Ang mga selula ng HeLa ay kinultura sa Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) na may suplementong 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, at 1.2 μg/ml streptomycin sa isang 37°C incubator na may 5% CO2.
Ang lahat ng mga eksperimento na inilarawan sa manuskritong ito ay isinagawa alinsunod sa mga regulasyon at alituntunin sa biosafety ng Hapon.
Ang mga compound ay tinunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) bilang stock solutions at dinilusaw sa MS medium para sa Arabidopsis at tobacco o Gamborg B5 medium para sa liverwort. Para sa root growth inhibition assay, mahigit sa 10 buto bawat plato ang itinanim sa agar medium na naglalaman ng mga ipinahiwatig na compound o DMSO. Ang mga buto ay in-incubate sa isang growth chamber sa loob ng 7 araw. Ang mga punla ay kinuhanan ng litrato at sinukat ang haba ng mga ugat. Para sa Arabidopsis germination assay, 48 buto bawat plato ang itinanim sa agar medium na naglalaman ng 200 μM compound o DMSO. Ang mga buto ng Arabidopsis ay itinanim sa isang growth chamber at ang bilang ng mga tumubong punla ay binilang 7 araw pagkatapos ng pagtubo (dag). Para sa tobacco germination assay, 24 na buto bawat plato ang itinanim sa agar medium na naglalaman ng 200 μM KAND o DMSO. Ang mga buto ng tabako ay itinanim sa isang growth chamber at ang bilang ng mga tumubong punla ay binilang pagkatapos ng 14 na araw. Para sa liverwort growth inhibition assay, 9 na embryo mula sa bawat plate ang inilagay sa agar medium na naglalaman ng ipinahiwatig na konsentrasyon ng KAND o DMSO at in-incubate sa isang growth chamber sa loob ng 14 na araw.
Gumamit ng mga punla na kinulayan ng 5 mg/ml propidium iodide (PI) upang mailarawan ang organisasyon ng meristem ng ugat. Ang mga signal ng PI ay inobserbahan gamit ang fluorescence microscopy gamit ang isang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).
Ang histochemical staining ng mga ugat gamit ang β-glucuronidase (GUS) ay isinagawa ayon sa protocol na inilarawan nina Malami at Benfey36. Ang mga punla ay inayos sa 90% acetone magdamag, kinulayan ng 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid sa GUS buffer sa loob ng 1 oras at inilagay sa isang hydrated chloraldehyde solution (8 g chloral hydrate, 2 ml tubig at 1 ml glycerol) at inobserbahan sa pamamagitan ng differential interference contrast microscopy gamit ang isang Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss).
Ang mga anggulo ng ugat ay sinukat sa mga punla na 7 araw ang edad na itinanim sa mga patayong plato. Sukatin ang anggulo ng ugat mula sa direksyon ng gravity vector gaya ng inilarawan sa hakbang 6.
Ang pagkakaayos ng mga cortical microtubule ay naobserbahan gaya ng inilarawan, na may kaunting mga pagbabago sa protocol 37. Ang anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) at Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ay ginamit bilang pangunahin at pangalawang antibody sa 1:1000 at 1:100 na mga dilusyon, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga imahe ng fluorescence ay nakuha gamit ang isang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems). Kumuha ng mga Z-stack na imahe at lumikha ng mga maximum intensity projection ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.
Isinagawa ang HeLa cell proliferation assay gamit ang Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ayon sa mga tagubilin ng gumawa.
Ang paglaki ng E. coli DH5α ay sinuri sa pamamagitan ng pagsukat ng densidad ng selula sa kultura gamit ang isang spectrophotometer sa 600 nm (OD600).
Ang organisasyon ng cytoskeletal sa mga transgenic BY-2 cell ay naobserbahan gamit ang isang fluorescence microscope na may kasamang CSU-X1 confocal scanning device (Yokogawa) at isang sCMOS camera (Zyla, Andor Technology). Ang densidad ng cytoskeletal ay tinasa sa pamamagitan ng image analysis, na sumukat sa porsyento ng mga cytoskeletal pixel sa mga cytoplasmic pixel sa mga confocal na imahe gamit ang ImageJ software gaya ng inilarawan38,39.
Upang matukoy ang pagkamatay ng selula sa mga selulang BY-2, isang aliquot ng suspensyon ng selula ang in-incubate gamit ang 0.05% Evans blue sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid. Ang pumipiling paglamlam ng Evans blue ng mga patay na selula ay nakadepende sa paglabas ng tina mula sa mga buhay na selula ng buo na plasma membrane40. Ang mga selulang may kulay ay inobserbahan gamit ang isang bright-field microscope (BX53, Olympus).
Ang mga selula ng HeLa ay pinalaki sa DMEM na may suplementong 10% FBS sa isang humidified incubator sa 37°C at 5% CO2. Ang mga selula ay ginamot gamit ang 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), o 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) sa loob ng 6 na oras sa 37°C. Ang mga selula ay inayos gamit ang MetOH sa loob ng 10 minuto at pagkatapos ay inayos gamit ang acetate sa loob ng 5 minuto sa temperatura ng silid. Ang mga inayos na selula ay in-incubate gamit ang β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) na diluted sa 0.5% BSA/PBS sa loob ng 2 oras, hinugasan ng 3 beses gamit ang TBST, at pagkatapos ay in-incubate gamit ang Alexa Fluor goat antibody. 488 sa loob ng 1 oras. – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) at 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) na hinaluan ng 0.5% BSA/PBS. Pagkatapos hugasan gamit ang TBST nang tatlong beses, ang mga selulang may kulay ay inobserbahan sa isang Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope. Ang mga imahe ay nakuha gamit ang isang pinalamig na Hamamatsu ORCA-R2 CCD camera gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Oras ng pag-post: Hunyo 17, 2024