Ang pine nematode ay isang quarantine migratory endoparasite na kilalang nagdudulot ng matinding pagkalugi sa ekonomiya sa mga ecosystem ng kagubatan ng pino. Sinusuri ng kasalukuyang pag-aaral ang nematicidal na aktibidad ng mga halogenated indole laban sa mga pine nematode at ang kanilang mekanismo ng pagkilos. Ang mga nematicidal na aktibidad ng 5-iodoindole at avermectin (positibong kontrol) laban sa mga pine nematode ay magkatulad at mataas sa mababang konsentrasyon (10 μg/mL). Binawasan ng 5-iodoindole ang fecundity, reproductive activity, embryonic at larval mortality, at locomotor behavior. Sinusuportahan ng mga molekular na interaksyon ng mga ligand na may mga invertebrate-specific glutamate-gated chloride channel receptor ang paniwala na ang 5-iodoindole, tulad ng avermectin, ay mahigpit na nagbibigkis sa aktibong site ng receptor. Nagdulot din ang 5-Iodoindole ng iba't ibang phenotypic deformations sa mga nematode, kabilang ang abnormal na pagbagsak/pag-urong ng organ at pagtaas ng vacuolization. Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang mga vacuole ay maaaring gumanap ng papel sa pagkamatay na dulot ng methylation ng nematode. Mahalaga, ang 5-iodoindole ay hindi nakalalason sa parehong uri ng halaman (repolyo at labanos). Kaya, ipinapakita ng pag-aaral na ito na ang paggamit ng iodoindole sa ilalim ng mga kondisyon ng kapaligiran ay maaaring makakontrol sa pinsala sa pagkalanta ng pino.
Ang pine wood nematode (Bursaphelenchus xylophilus) ay kabilang sa mga pine wood nematode (PWN), mga migratory endoparasitic nematode na kilalang nagdudulot ng matinding pinsala sa ekolohiya sa mga ecosystem ng kagubatan ng pino1. Ang pine wilt disease (PWD) na dulot ng pine wood nematode ay nagiging isang seryosong problema sa ilang kontinente, kabilang ang Asya at Europa, at sa Hilagang Amerika, sinisira ng nematode ang mga ipinakilalang uri ng pino1,2. Ang pagbaba ng mga puno ng pino ay isang pangunahing problema sa ekonomiya, at ang posibilidad ng pandaigdigang pagkalat nito ay nakababahala3. Ang mga sumusunod na uri ng pino ang pinakakaraniwang inaatake ng nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, at Pinus radiata4. Ang pine nematode ay isang malubhang sakit na maaaring pumatay sa mga puno ng pino sa loob ng ilang linggo o buwan pagkatapos ng impeksyon. Bukod pa rito, ang mga pagsiklab ng pine nematode ay karaniwan sa iba't ibang ecosystem, kaya't naitatag na ang mga persistent infection chain1.
Ang Bursaphelenchus xylophilus ay isang quarantine plant-parasitic nematode na kabilang sa superfamily na Aphelenchoidea at clade 102.5. Ang nematode ay kumakain ng fungi at nagpaparami sa mga tisyu ng kahoy ng mga puno ng pino, na nabubuo sa apat na magkakaibang yugto ng larva: L1, L2, L3, L4 at isang nasa hustong gulang na indibidwal1,6. Sa ilalim ng mga kondisyon ng kakulangan sa pagkain, ang pine nematode ay pumapasok sa isang espesyal na yugto ng larva – ang dauer, na nagpapaparasito sa vector nito – ang pine bark beetle (Monochamus alternatus) at inililipat sa malulusog na puno ng pino. Sa malulusog na host, ang mga nematode ay mabilis na lumilipat sa mga tisyu ng halaman at kumakain sa mga parenchymatous cell, na humahantong sa ilang mga reaksiyong hypersensitivity, pagkalanta ng pino at pagkamatay sa loob ng isang taon pagkatapos ng impeksyon1,7,8.
Matagal nang naging hamon ang biyolohikal na pagkontrol sa mga pine nematode, na ang mga hakbang sa kuwarentenas ay nagsimula pa noong ika-20 siglo. Ang mga kasalukuyang estratehiya para sa pagkontrol sa mga pine nematode ay pangunahing kinabibilangan ng mga kemikal na paggamot, kabilang ang pagpapausok ng kahoy at pagtatanim ng mga nematicide sa mga puno. Ang mga pinakakaraniwang ginagamit na nematicide ay ang avermectin at avermectin benzoate, na kabilang sa pamilya ng avermectin. Ang mga mamahaling kemikal na ito ay lubos na epektibo laban sa maraming uri ng nematode at itinuturing na ligtas sa kapaligiran9. Gayunpaman, ang paulit-ulit na paggamit ng mga nematicide na ito ay inaasahang lilikha ng presyon ng pagpili na halos tiyak na hahantong sa paglitaw ng mga lumalaban na pine nematode, tulad ng naipakita para sa ilang mga peste ng insekto, tulad ng Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella at ang mga nematode na Trichostrongylus colubriformis at Ostertagia circumcincta, na unti-unting nagkakaroon ng resistensya sa mga avermectins10,11,12. Samakatuwid, ang mga pattern ng resistensya ay kailangang regular na pag-aralan at ang mga nematicide ay patuloy na sinusuri upang makahanap ng alternatibo, cost-effective at environment-friendly na mga hakbang upang makontrol ang PVD. Sa mga nakalipas na dekada, maraming mga may-akda ang nagpanukala ng paggamit ng mga katas ng halaman, mahahalagang langis, at mga pabagu-bago ng isip bilang mga ahente sa pagkontrol ng nematode13,14,15,16.
Kamakailan lamang ay ipinakita namin ang nematicidal na aktibidad ng indole, isang intercellular at interkingdom signaling molecule, sa Caenorhabditis elegans 17. Ang Indole ay isang malawakang intracellular signal sa microbial ecology, na kumokontrol sa maraming tungkulin na nakakaapekto sa microbial physiology, spore formation, plasmid stability, drug resistance, biofilm formation, at virulence 18, 19. Ang aktibidad ng indole at mga derivatives nito laban sa iba pang pathogenic nematodes ay hindi pa napag-aaralan. Sa pag-aaral na ito, sinuri namin ang nematicidal na aktibidad ng 34 na indoles laban sa pine nematodes at nilinaw ang mekanismo ng pagkilos ng pinakamalakas na 5-iodoindole gamit ang microscopy, time-lapse photography, at mga molecular docking experiments, at tinasa ang mga nakalalasong epekto nito sa mga halaman gamit ang seed germination assay.
Ang mataas na konsentrasyon (>1.0 mM) ng indole ay naiulat na dati nang mayroong nematicidal na epekto sa mga nematode17. Kasunod ng paggamot sa B. xylophilus (magkahalong yugto ng buhay) gamit ang indole o 33 iba't ibang indole derivatives sa 1 mM, ang mortalidad ng B. xylophilus ay sinukat sa pamamagitan ng pagbibilang ng mga buhay at patay na nematode sa mga grupong kontrol at ginamot. Limang indole ang nagpakita ng makabuluhang aktibidad na nematicidal; ang survival ng hindi ginamot na control group ay 95 ± 7% pagkatapos ng 24 oras. Sa 34 na indole na sinubukan, ang 5-iodoindole at 4-fluoroindole sa 1 mM ay nagdulot ng 100% na mortalidad, samantalang ang 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate, at 7-iodoindole ay nagdulot ng humigit-kumulang 50% na mortalidad (Talahanayan 1).
Epekto ng 5-iodoindole sa pagbuo at metabolismo ng vacuole ng pine wood nematode. (A) Epekto ng avermectin at 5-iodoindole sa mga adultong lalaking nematode, (B) L1 stage na itlog ng nematode at (C) metabolismo ng B. xylophilus, (i) ang mga vacuole ay hindi naobserbahan sa ika-0 oras, ang paggamot ay nagresulta sa (ii) mga vacuole, (iii) akumulasyon ng maraming vacuole, (iv) pamamaga ng mga vacuole, (v) pagsasanib ng mga vacuole at (vi) pagbuo ng mga higanteng vacuole. Ang mga pulang palaso ay nagpapahiwatig ng pamamaga ng mga vacuole, ang mga asul na palaso ay nagpapahiwatig ng pagsasanib ng mga vacuole at ang mga itim na palaso ay nagpapahiwatig ng mga higanteng vacuole. Scale bar = 50 μm.
Bukod pa rito, inilarawan din ng pag-aaral na ito ang sunud-sunod na proseso ng pagkamatay na dulot ng methane sa mga pine nematode (Larawan 4C). Ang methanogenic death ay isang non-apoptotic na uri ng pagkamatay ng selula na nauugnay sa akumulasyon ng mga prominenteng cytoplasmic vacuole27. Ang mga depektong morpolohikal na naobserbahan sa mga pine nematode ay tila malapit na nauugnay sa mekanismo ng pagkamatay na dulot ng methane. Ipinakita ng mikroskopikong pagsusuri sa iba't ibang oras na nabuo ang mga higanteng vacuole pagkatapos ng 20 oras na pagkakalantad sa 5-iodoindole (0.1 mM). Naobserbahan ang mga mikroskopikong vacuole pagkatapos ng 8 oras ng paggamot, at tumaas ang kanilang bilang pagkatapos ng 12 oras. Maraming malalaking vacuole ang naobserbahan pagkatapos ng 14 na oras. Maraming nagsanib na vacuole ang malinaw na nakikita pagkatapos ng 12-16 na oras ng paggamot, na nagpapahiwatig na ang vacuole fusion ang batayan ng mekanismo ng methanogenic death. Pagkatapos ng 20 oras, ilang higanteng vacuole ang natagpuan sa buong bulate. Ang mga obserbasyong ito ay kumakatawan sa unang ulat ng metuosis sa C. elegans.
Sa mga bulate na ginamot gamit ang 5-iodoindole, naobserbahan din ang pagsasama-sama at pagkapunit ng vacuole (Fig. 5), gaya ng pinatutunayan ng pagbaluktot ng bulate at paglabas ng vacuole sa kapaligiran. Naobserbahan din ang pagkagambala ng vacuole sa lamad ng balat ng itlog, na karaniwang napapanatiling buo ng L2 habang napisa (Supplementary Fig. S2). Sinusuportahan ng mga obserbasyong ito ang pagkakasangkot ng akumulasyon ng likido at pagkabigo ng osmoregulatory, pati na rin ang reversible cell injury (RCI), sa proseso ng pagbuo at pagdurugo ng vacuole (Fig. 5).
Sa pag-hipotesis ng papel ng iodine sa naobserbahang pagbuo ng vacuole, sinuri namin ang nematicidal na aktibidad ng sodium iodide (NaI) at potassium iodide (KI). Gayunpaman, sa mga konsentrasyon (0.1, 0.5 o 1 mM), hindi nila naapektuhan ang kaligtasan ng nematode o ang pagbuo ng vacuole (Supplementary Fig. S5), bagama't ang 1 mM KI ay may bahagyang nematicidal na epekto. Sa kabilang banda, ang 7-iodoindole (1 o 2 mM), tulad ng 5-iodoindole, ay nagdulot ng maraming vacuole at mga deformasyon sa istruktura (Supplementary Fig. S6). Ang dalawang iodoindole ay nagpakita ng magkatulad na phenotypic na katangian sa mga pine nematode, samantalang ang NaI at KI ay hindi. Kapansin-pansin, ang indole ay hindi nagdulot ng pagbuo ng vacuole sa B. xylophilus sa mga konsentrasyong sinubukan (hindi ipinakita ang datos). Kaya, kinumpirma ng mga resulta na ang indole-iodine complex ang responsable para sa vacuolization at metabolismo ng B. xylophilus.
Sa mga indoles na sinubukan para sa nematicidal activity, ang 5-iodoindole ay may pinakamataas na slip index na -5.89 kcal/mol, kasunod ang 7-iodoindole (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4.33), at indole (-4.03) (Figure 6). Ang malakas na backbone hydrogen bonding ng 5-iodoindole sa leucine 218 ay nagpapatatag sa pagbigkis nito, samantalang ang lahat ng iba pang indole derivatives ay nagbibigkis sa serine 260 sa pamamagitan ng side chain hydrogen bonds. Sa iba pang mga na-model na iodoindole, ang 2-iodoindole ay may binding value na -5.248 kcal/mol, na dahil sa pangunahing hydrogen bond nito sa leucine 218. Kabilang sa iba pang kilalang bindings ang 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4.0 kcal/mol), at 6-fluoroindole (-2.6 kcal/mol) (Karagdagang Figure S8). Karamihan sa mga halogenated indole at indole mismo, maliban sa 5-iodoindole at 2-iodoindole, ay bumubuo ng isang bond sa serine 260. Ang katotohanan na ang hydrogen bonding sa leucine 218 ay nagpapahiwatig ng mahusay na receptor-ligand binding, gaya ng naobserbahan para sa ivermectin (Supplementary Fig. S7), ay nagpapatunay na ang 5-iodoindole at 2-iodoindole, tulad ng ivermectin, ay mahigpit na nagbibigkis sa aktibong site ng GluCL receptor sa pamamagitan ng leucine 218 (Fig. 6 at Supplementary Fig. S8). Iminumungkahi namin na ang pagbubuklod na ito ay kinakailangan upang mapanatili ang bukas na istruktura ng butas ng GluCL complex at sa pamamagitan ng mahigpit na pagbubuklod sa aktibong site ng GluCL receptor, ang 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin at ivermectin ay nagpapanatili sa ion channel na bukas at nagpapahintulot sa fluid uptake.
Molecular docking ng indole at halogenated indole sa GluCL. Mga oryentasyon ng pagbigkis ng (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, at (D) 5-iodoindole ligands sa aktibong site ng GluCL. Ang protina ay kinakatawan ng isang laso, at ang mga backbone hydrogen bond ay ipinapakita bilang mga dilaw na tuldok-tuldok na linya. Ang (A′), (B′), (C′), at (D′) ay nagpapakita ng mga interaksyon ng mga kaukulang ligand sa mga nakapalibot na amino acid residue, at ang mga side-chain hydrogen bond ay ipinapahiwatig ng mga kulay rosas na tuldok-tuldok na arrow.
Isinagawa ang mga eksperimento upang suriin ang nakalalasong epekto ng 5-iodoindole sa pagtubo ng mga buto ng repolyo at labanos. Ang 5-iodoindole (0.05 o 0.1 mM) o avermectin (10 μg/mL) ay may kaunti o walang epekto sa paunang pagtubo at paglitaw ng plantlet (Larawan 7). Bukod pa rito, walang natagpuang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng rate ng pagtubo ng mga hindi ginagamot na kontrol at mga butong ginagamot ng 5-iodoindole o avermectin. Ang epekto sa paghaba ng taproot at bilang ng mga lateral root na nabuo ay hindi gaanong mahalaga, bagaman ang 1 mM (10 beses ang aktibong konsentrasyon nito) ng 5-iodoindole ay bahagyang nagpaantala sa pag-unlad ng mga lateral root. Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang 5-iodoindole ay hindi nakalalason sa mga selula ng halaman at hindi nakakasagabal sa mga proseso ng pag-unlad ng halaman sa mga konsentrasyong pinag-aralan.
Epekto ng 5-iodoindole sa pagtubo ng binhi. Pagtubo, pagsibol, at pag-ugat sa gilid ng mga buto ng B. oleracea at R. raphanistrum sa medium ng Murashige at Skoog agar na mayroon o walang avermectin o 5-iodoindole. Naitala ang pagtubo pagkatapos ng 3 araw na inkubasyon sa 22°C.
Iniuulat ng pag-aaral na ito ang ilang kaso ng pagpatay sa mga nematode ng mga indole. Mahalaga, ito ang unang ulat ng methylation na nagdudulot ng iodoindole (isang prosesong dulot ng akumulasyon ng maliliit na vacuole na unti-unting nagsasama-sama bilang higanteng mga vacuole, na kalaunan ay humahantong sa pagkapunit ng lamad at pagkamatay) sa mga karayom ng pino, kung saan ang iodoindole ay nagpapakita ng mga makabuluhang katangiang nematicidal na katulad ng sa komersyal na nematicide avermectin.
Nauna nang naiulat na ang mga indole ay nagsasagawa ng maraming tungkulin sa pagbibigay ng senyas sa mga prokaryote at eukaryote, kabilang ang pagpigil/pagbuo ng biofilm, kaligtasan ng bakterya, at pathogenicity19,32,33,34. Kamakailan lamang, ang mga potensyal na therapeutic effect ng mga halogenated indole, indole alkaloid, at semisynthetic indole derivatives ay nakaakit ng malawak na interes sa pananaliksik35,36,37. Halimbawa, ang mga halogenated indole ay naipakita na pumapatay ng mga persistent Escherichia coli at Staphylococcus aureus cells37. Bukod pa rito, may siyentipikong interes na pag-aralan ang bisa ng mga halogenated indole laban sa iba pang mga species, genera, at kingdom, at ang pag-aaral na ito ay isang hakbang tungo sa pagkamit ng layuning ito.
Dito, nagmumungkahi kami ng isang mekanismo para sa 5-iodoindole-induced lethality sa C. elegans batay sa reversible cell injury (RCI) at methylation (Mga Larawan 4C at 5). Ang mga pagbabago sa edema tulad ng pamamaga at vacuolar degeneration ay mga indikasyon ng RCI at methylation, na ipinapakita bilang mga higanteng vacuole sa cytoplasm48,49. Nakakasagabal ang RCI sa produksyon ng enerhiya sa pamamagitan ng pagbabawas ng produksyon ng ATP, na nagdudulot ng pagkabigo ng ATPase pump, o paggambala sa mga lamad ng cell at nagdudulot ng mabilis na pagdagsa ng Na+, Ca2+, at tubig50,51,52. Ang mga intracytoplasmic vacuole ay lumilitaw sa mga selula ng hayop bilang resulta ng akumulasyon ng likido sa cytoplasm dahil sa pagdagsa ng Ca2+ at tubig53. Kapansin-pansin, ang mekanismong ito ng pinsala sa selula ay nababaligtad kung ang pinsala ay pansamantala at ang mga selula ay nagsisimulang gumawa ng ATP sa loob ng isang tiyak na tagal ng panahon, ngunit kung ang pinsala ay magpapatuloy o lumala, ang mga selula ay namamatay.54 Ipinapakita ng aming mga obserbasyon na ang mga nematode na ginagamot ng 5-iodoindole ay hindi kayang ibalik ang normal na biosynthesis pagkatapos malantad sa mga kondisyon ng stress.
Ang methylation phenotype na dulot ng 5-iodoindole sa B. xylophilus ay maaaring dahil sa presensya ng iodine at sa molekular na distribusyon nito, dahil ang 7-iodoindole ay may mas kaunting inhibitory effect sa B. xylophilus kaysa sa 5-iodoindole (Table 1 at Supplementary Figure S6). Ang mga resultang ito ay bahagyang naaayon sa mga pag-aaral nina Maltese et al. (2014), na nag-ulat na ang translocation ng pyridyl nitrogen moiety sa indole mula sa para- patungo sa meta-position ay nag-alis ng vacuolization, growth inhibition, at cytotoxicity sa mga U251 cell, na nagmumungkahi na ang interaksyon ng molekula sa isang partikular na aktibong site sa protina ay kritikal27,44,45. Ang mga interaksyon sa pagitan ng indole o halogenated indoles at GluCL receptors na naobserbahan sa pag-aaral na ito ay sumusuporta rin sa ideyang ito, dahil ang 5- at 2-iodoindole ay natagpuang mas malakas na nagbibigkis sa mga GluCL receptor kaysa sa iba pang mga indoles na sinuri (Figure 6 at Supplementary Figure S8). Ang iodine sa pangalawa o panglimang posisyon ng indole ay natagpuang nagbibigkis sa leucine 218 ng GluCL receptor sa pamamagitan ng backbone hydrogen bonds, samantalang ang iba pang halogenated indole at ang indole mismo ay bumubuo ng mahihinang side-chain hydrogen bonds na may serine 260 (Larawan 6). Samakatuwid, ipinapalagay namin na ang lokalisasyon ng halogen ay may mahalagang papel sa pag-udyok ng vacuolar degeneration, samantalang ang mahigpit na pagbubuklod ng 5-iodoindole ay nagpapanatiling bukas sa ion channel, sa gayon ay nagpapahintulot sa mabilis na pag-agos ng likido at pagputok ng vacuole. Gayunpaman, ang detalyadong mekanismo ng pagkilos ng 5-iodoindole ay kailangan pang matukoy.
Bago ang praktikal na paggamit ng 5-iodoindole, dapat munang suriin ang nakalalasong epekto nito sa mga halaman. Ipinakita ng aming mga eksperimento sa pagtubo ng binhi na ang 5-iodoindole ay walang negatibong epekto sa pagtubo ng binhi o mga kasunod na proseso ng pag-unlad sa mga konsentrasyong pinag-aralan (Larawan 7). Kaya naman, ang pag-aaral na ito ay nagbibigay ng batayan para sa paggamit ng 5-iodoindole sa ekolohikal na kapaligiran upang makontrol ang pinsala ng mga pine nematode sa mga puno ng pino.
Ipinakita ng mga nakaraang ulat na ang indole-based therapy ay kumakatawan sa isang potensyal na pamamaraan upang matugunan ang problema ng antibiotic resistance at paglala ng kanser55. Bukod pa rito, ang mga indole ay nagtataglay ng mga antibacterial, anticancer, antioxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, antiviral, antiproliferative at antituberculosis na aktibidad at maaaring magsilbing isang promising na batayan para sa pagbuo ng gamot56,57. Iminumungkahi ng pag-aaral na ito sa unang pagkakataon ang potensyal na paggamit ng iodine bilang isang antiparasitic at anthelmintic agent.
Natuklasan ang Avermectin tatlong dekada na ang nakalilipas at nanalo ng Nobel Prize noong 2015, at ang paggamit nito bilang anthelmintic ay aktibo pa ring nagpapatuloy. Gayunpaman, dahil sa mabilis na pag-unlad ng resistensya sa mga avermectin sa mga nematode at peste ng insekto, kinakailangan ang isang alternatibo, mababa ang gastos, at environment-friendly na estratehiya upang makontrol ang impeksyon ng PWN sa mga puno ng pino. Iniuulat din ng pag-aaral na ito ang mekanismo kung paano pinapatay ng 5-iodoindole ang mga pine nematode at ang 5-iodoindole ay may mababang toxicity sa mga selula ng halaman, na nagbubukas ng magagandang pagkakataon para sa komersyal na aplikasyon nito sa hinaharap.
Ang lahat ng mga eksperimento ay inaprubahan ng Ethics Committee ng Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, at ang mga pamamaraan ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin ng Ethics Committee ng Yeungnam University.
Isinagawa ang mga eksperimento sa pagpapapisa ng itlog gamit ang mga itinakdang pamamaraan43. Upang masuri ang mga rate ng pagpisa (HR), ang mga 1-araw na gulang na adult nematode (humigit-kumulang 100 babae at 100 lalaki) ay inilipat sa mga Petri dish na naglalaman ng fungus at hinayaan na lumaki sa loob ng 24 na oras. Ang mga itlog ay inihiwalay at ginamot gamit ang 5-iodoindole (0.05 mM at 0.1 mM) o avermectin (10 μg/ml) bilang isang suspensyon sa isterilisadong distilled water. Ang mga suspensyon na ito (500 μl; humigit-kumulang 100 itlog) ay inilipat sa mga balon ng isang 24-well tissue culture plate at in-incubate sa 22 °C. Ang mga bilang ng L2 ay ginawa pagkatapos ng 24 na oras ng pagpapapisa ngunit itinuturing na patay kung ang mga selula ay hindi gumalaw kapag pinasigla gamit ang isang pinong platinum wire. Ang eksperimentong ito ay isinagawa sa dalawang yugto, bawat isa ay may anim na pag-uulit. Ang datos mula sa parehong eksperimento ay pinagsama at ipinakita. Ang porsyento ng HR ay kinakalkula tulad ng sumusunod:
Ang mortalidad ng larva ay tinasa gamit ang mga dati nang binuong pamamaraan. Ang mga itlog ng nematode ay kinolekta at ang mga embryo ay sinimnon sa pamamagitan ng pagpisa sa isterilisadong distilled water upang makabuo ng larvae sa L2 stage. Ang mga sinimnon na larvae (humigit-kumulang 500 nematode) ay ginamot gamit ang 5-iodoindole (0.05 mM at 0.1 mM) o avermectin (10 μg/ml) at pinalaki sa mga B. cinerea Petri plate. Pagkatapos ng 48 oras na incubation sa 22 °C, ang mga nematode ay kinolekta sa isterilisadong distilled water at sinuri para sa presensya ng mga yugto ng L2, L3, at L4. Ang presensya ng mga yugto ng L3 at L4 ay nagpapahiwatig ng pagbabagong-anyo ng larva, samantalang ang presensya ng yugto ng L2 ay nagpapahiwatig ng walang pagbabagong-anyo. Ang mga imahe ay nakuha gamit ang iRiS™ Digital Cell Imaging System. Ang eksperimentong ito ay isinagawa sa dalawang yugto, bawat isa ay may anim na pag-uulit. Ang datos mula sa parehong eksperimento ay pinagsama at ipinakita.
Ang toxicity ng 5-iodoindole at avermectin sa mga buto ay tinasa gamit ang mga germination test sa Murashige at Skoog agar plates.62 Ang mga buto ng B. oleracea at R. raphanistrum ay unang ibinabad sa sterile distilled water sa loob ng isang araw, hinugasan gamit ang 1 ml 100% ethanol, isterilisado gamit ang 1 ml 50% commercial bleach (3% sodium hypochlorite) sa loob ng 15 minuto, at hinugasan ng limang beses gamit ang 1 ml sterile water. Ang mga isterilisadong buto ay idiniin sa mga germination agar plates na naglalaman ng 0.86 g/l (0.2X) Murashige at Skoog medium at 0.7% bacteriological agar na mayroon o walang 5-iodoindole o avermectin. Ang mga plate ay in-incubate sa 22 °C, at kinuhanan ng mga larawan pagkatapos ng 3 araw ng incubation. Ang eksperimentong ito ay isinagawa sa dalawang yugto, na ang bawat isa ay may anim na pag-uulit.
Oras ng pag-post: Pebrero 26, 2025