Ang paglago ng shoot apical meristem (SAM) ay kritikal para sa arkitektura ng stem. Mga hormone ng halamangibberellin(GAs) ay gumaganap ng mga pangunahing tungkulin sa pag-uugnay ng paglago ng halaman, ngunit ang kanilang papel sa SAM ay nananatiling hindi gaanong nauunawaan. Dito, bumuo kami ng ratiometric biosensor ng GA signaling sa pamamagitan ng pag-engineer ng DELLA protein para sugpuin ang mahahalagang regulatory function nito sa GA transcriptional response habang pinapanatili ang pagkasira nito sa pagkilala sa GA. Ipinakita namin na ang biosensor na nakabatay sa degradasyon na ito ay tumpak na nagtatala ng mga pagbabago sa mga antas ng GA at cellular sensing sa panahon ng pag-unlad. Ginamit namin ang biosensor na ito para imapa ang aktibidad ng pagsenyas ng GA sa SAM. Ipinapakita namin na ang mga mataas na signal ng GA ay nakararami sa mga cell na matatagpuan sa pagitan ng organ primordia, na mga precursor sa internode cells. Gamit ang mga diskarte sa gain- at loss-of-function, lalo naming ipinapakita na kinokontrol ng GA ang oryentasyon ng cell division plane, na nagtatatag ng canonical cellular organization ng internodes, at sa gayon ay nagpo-promote ng internode specification sa SAM.
Ang shoot apical meristem (SAM), na matatagpuan sa shoot apex, ay naglalaman ng isang angkop na lugar ng mga stem cell na ang aktibidad ay bumubuo ng mga lateral organ at stem node sa isang modular at umuulit na paraan sa buong buhay ng halaman. Ang bawat isa sa mga paulit-ulit na yunit na ito, o mga node ng halaman, ay kinabibilangan ng mga internode at lateral organ sa mga node, at mga axillary meristem sa mga axils ng dahon1. Ang paglaki at organisasyon ng mga node ng halaman ay nagbabago sa panahon ng pag-unlad. Sa Arabidopsis, ang paglago ng internodal ay pinigilan sa panahon ng vegetative stage, at ang mga axillary meristem ay nananatiling natutulog sa mga axils ng mga dahon ng rosette. Sa panahon ng paglipat sa floral phase, ang SAM ay nagiging inflorescence meristem, na bumubuo ng mga elongated internodes at axillary buds, branchlets sa axils ng cauline leaves, at kalaunan, walang dahon na mga bulaklak2. Bagama't nakagawa kami ng makabuluhang pag-unlad sa pag-unawa sa mga mekanismo na kumokontrol sa pagsisimula ng mga dahon, bulaklak, at mga sanga, medyo kaunti ang nalalaman tungkol sa kung paano umusbong ang mga internode.
Ang pag-unawa sa spatiotemporal distribution ng mga GA ay makakatulong upang mas maunawaan ang mga function ng mga hormone na ito sa iba't ibang mga tissue at sa iba't ibang yugto ng pag-unlad. Ang visualization ng pagkasira ng RGA-GFP fusion na ipinahayag sa ilalim ng pagkilos ng sarili nitong tagataguyod ay nagbibigay ng mahalagang impormasyon sa regulasyon ng kabuuang antas ng GA sa mga ugat15,16. Gayunpaman, ang expression ng RGA ay nag-iiba sa mga tisyu17 at kinokontrol ng GA18. Kaya, ang pagpapahayag ng kaugalian ng tagataguyod ng RGA ay maaaring magresulta sa pattern ng pag-ilaw na sinusunod sa RGA-GFP at sa gayon ang pamamaraang ito ay hindi dami. Kamakailan lamang, ang bioactive fluorescein (Fl) na may label na GA19,20 ay nagsiwalat ng akumulasyon ng GA sa root endocortex at ang regulasyon ng mga antas ng cellular nito sa pamamagitan ng transportasyon ng GA. Kamakailan lamang, ipinakita ng GA FRET sensor nlsGPS1 na ang mga antas ng GA ay nauugnay sa pagpapahaba ng cell sa mga ugat, filament, at dark-grown hypocotyls21. Gayunpaman, tulad ng nakita natin, ang konsentrasyon ng GA ay hindi lamang ang parameter na kumokontrol sa aktibidad ng pagsenyas ng GA, dahil nakadepende ito sa mga kumplikadong proseso ng sensing. Dito, batay sa aming pag-unawa sa DELLA at GA signaling pathways, iniuulat namin ang pagbuo at characterization ng isang degradation-based ratiometric biosensor para sa GA signaling. Upang mabuo ang quantitative biosensor na ito, gumamit kami ng mutant GA-sensitive RGA na pinagsama sa isang fluorescent protein at ubiquitously na ipinahayag sa mga tisyu, pati na rin isang GA-insensitive fluorescent protein. Ipinakita namin na ang mutant RGA protein fusions ay hindi nakakasagabal sa endogenous GA signaling kapag ubiquitously ipinahayag, at na ang biosensor na ito ay maaaring tumyak ng senyas na aktibidad na nagreresulta mula sa parehong GA input at GA signal processing sa pamamagitan ng sensing apparatus na may mataas na spatiotemporal resolution. Ginamit namin ang biosensor na ito para i-map ang spatiotemporal distribution ng GA signaling activity at mabilang kung paano kinokontrol ng GA ang cellular behavior sa SAM epidermis. Ipinakita namin na kinokontrol ng GA ang oryentasyon ng division plane ng SAM cells na matatagpuan sa pagitan ng organ primordia, at sa gayon ay tinutukoy ang canonical cellular organization ng internode.
Sa wakas, tinanong namin kung ang qmRGA ay maaaring mag-ulat ng mga pagbabago sa mga endogenous na antas ng GA gamit ang lumalaking hypocotyl. Ipinakita namin dati na ang nitrate ay nagpapasigla sa paglaki sa pamamagitan ng pagtaas ng GA synthesis at, sa turn, ang pagkasira ng DELLA34. Alinsunod dito, napansin namin na ang haba ng hypocotyl sa pUBQ10::qmRGA na mga punla na lumago sa ilalim ng masaganang suplay ng nitrate (10 mM NO3−) ay higit na mas mahaba kaysa sa mga punla na lumaki sa ilalim ng mga kondisyong kulang sa nitrate (Karagdagang Larawan 6a). Alinsunod sa tugon ng paglago, ang mga signal ng GA ay mas mataas sa hypocotyls ng mga seedlings na lumago sa ilalim ng 10 mM NO3− na kondisyon kaysa sa mga seedlings na lumago sa kawalan ng nitrate (Karagdagang Fig. 6b, c). Kaya, pinapagana din ng qmRGA ang pagsubaybay sa mga pagbabago sa pagsenyas ng GA na dulot ng mga endogenous na pagbabago sa konsentrasyon ng GA.
Upang maunawaan kung ang aktibidad ng senyas ng GA na nakita ng qmRGA ay nakasalalay sa konsentrasyon ng GA at pananaw ng GA, tulad ng inaasahan batay sa disenyo ng sensor, sinuri namin ang pagpapahayag ng tatlong GID1 receptor sa mga vegetative at reproductive tissue. Sa mga punla, ipinakita ng linya ng reporter ng GID1-GUS na ang GID1a at c ay lubos na ipinahayag sa mga cotyledon (Larawan 3a–c). Bilang karagdagan, ang lahat ng tatlong mga receptor ay ipinahayag sa mga dahon, lateral root primordia, mga tip sa ugat (maliban sa root cap ng GID1b), at ang vascular system (Fig. 3a–c). Sa inflorescence SAM, nakita namin ang mga signal ng GUS para lamang sa GID1b at 1c (Karagdagang Fig. 7a–c). Kinumpirma ng in situ hybridization ang mga pattern ng expression na ito at higit pang ipinakita na ang GID1c ay pantay na ipinahayag sa mababang antas sa SAM, samantalang ang GID1b ay nagpakita ng mas mataas na expression sa periphery ng SAM (Karagdagang Fig. 7d–l). Ang pGID1b::2xmTQ2-GID1b translational fusion ay nagsiwalat din ng graded range ng GID1b expression, mula sa mababa o walang expression sa gitna ng SAM hanggang sa mataas na expression sa mga hangganan ng organ (Karagdagang Fig. 7m). Kaya, ang mga receptor ng GID1 ay hindi pantay na ipinamamahagi sa kabuuan at sa loob ng mga tisyu. Sa kasunod na mga eksperimento, napagmasdan din namin na ang sobrang pagpapahayag ng GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ay nagpapataas ng sensitivity ng qmRGA sa hypocotyls sa panlabas na aplikasyon ng GA (Fig. 3d, e). Sa kaibahan, ang fluorescence na sinusukat ng qd17mRGA sa hypocotyl ay hindi sensitibo sa paggamot sa GA3 (Larawan 3f, g). Para sa parehong mga assay, ang mga punla ay ginagamot na may mataas na konsentrasyon ng GA (100 μM GA3) upang masuri ang mabilis na pag-uugali ng sensor, kung saan ang kakayahang magbigkis sa GID1 receptor ay pinahusay o nawala. Sama-sama, kinukumpirma ng mga resultang ito na ang qmRGA biosensor ay nagsisilbi ng isang pinagsamang function bilang isang GA at GA sensor, at iminumungkahi na ang differential expression ng GID1 receptor ay maaaring makabuluhang baguhin ang emissivity ng sensor.
Sa ngayon, nananatiling hindi malinaw ang pamamahagi ng mga signal ng GA sa SAM. Samakatuwid, ginamit namin ang qmRGA-expressing plants at ang pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 upang kalkulahin ang mga high-resolution na quantitative na mga mapa ng aktibidad ng pagsenyas ng GA, na tumutuon sa L1 layer (epidermis; Fig. 4a, b, tingnan ang Mga Paraan at Mga Karagdagang Paraan), dahil ang L1 ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pagkontrol sa paglago ng SAM36. Dito, ang pCLV3::mCherry-NLS expression ay nagbigay ng nakapirming geometric reference point para sa pagsusuri sa spatiotemporal distribution ng GA signaling activity37. Bagama't itinuturing na mahalaga ang GA para sa pag-unlad ng lateral organ4, napansin namin na mababa ang mga signal ng GA sa floral primordium (P) simula sa P3 stage (Fig. 4a, b), samantalang ang mga batang P1 at P2 primordium ay may katamtamang aktibidad na katulad ng sa gitnang rehiyon (Fig. 4a, b). Ang mas mataas na aktibidad ng pagsenyas ng GA ay nakita sa mga hangganan ng organ primordium, simula sa P1/P2 (sa gilid ng hangganan) at peaking sa P4, pati na rin sa lahat ng mga cell ng peripheral na rehiyon na matatagpuan sa pagitan ng primordia (Larawan 4a, b at Karagdagang Fig. 8a, b). Ang mas mataas na aktibidad ng senyas ng GA na ito ay naobserbahan hindi lamang sa epidermis kundi pati na rin sa mga layer ng L2 at upper L3 (Karagdagang Fig. 8b). Ang pattern ng mga signal ng GA na nakita sa SAM gamit ang qmRGA ay nanatiling hindi nagbabago sa paglipas ng panahon (Karagdagang Fig. 8c–f, k). Bagaman ang konstruksyon ng qd17mRGA ay sistematikong na-downregulated sa SAM ng mga halaman ng T3 mula sa limang independiyenteng linya na nailalarawan namin nang detalyado, nagawa naming suriin ang mga pattern ng fluorescence na nakuha gamit ang pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP construct (Karagdagang Fig. 8g–j, l). Sa control line na ito, ang mga maliliit na pagbabago lamang sa fluorescence ratio ang nakita sa SAM, ngunit sa SAM center nakita namin ang isang malinaw at hindi inaasahang pagbaba sa VENUS na nauugnay sa TagBFP. Kinukumpirma nito na ang pattern ng pagbibigay ng senyas na sinusunod ng qmRGA ay sumasalamin sa GA-dependent na degradasyon ng mRGA-VENUS, ngunit ipinapakita din na ang qmRGA ay maaaring mag-overestimate sa aktibidad ng senyas ng GA sa meristem center. Sa buod, ipinapakita ng aming mga resulta ang isang pattern ng pagsenyas ng GA na pangunahing sumasalamin sa pamamahagi ng primordia. Ang distribusyon na ito ng inter-primordial region (IPR) ay dahil sa unti-unting pagtatatag ng mataas na aktibidad ng senyas ng GA sa pagitan ng pagbuo ng primordium at ng gitnang rehiyon, habang kasabay nito ay bumababa ang aktibidad ng senyas ng GA sa primordium (Larawan 4c, d).
Ang distribusyon ng GID1b at GID1c receptors (tingnan sa itaas) ay nagmumungkahi na ang differential expression ng GA receptors ay nakakatulong sa paghubog ng pattern ng GA signaling activity sa SAM. Nagtaka kami kung maaaring kasangkot ang differential accumulation ng GA. Upang imbestigahan ang posibilidad na ito, ginamit namin ang nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ang pagtaas ng dalas ng pag-activate ay nakita sa SAM ng nlsGPS1 na ginagamot ng 10 μM GA4 + 7 sa loob ng 100 min (Karagdagang Fig. 9a-e), na nagpapahiwatig na ang nlsGPS1 ay tumutugon sa mga pagbabago sa konsentrasyon ng GA sa SAM, tulad ng ginagawa nito sa roots21. Ang spatial na pamamahagi ng dalas ng pag-activate ng nlsGPS1 ay nagsiwalat ng medyo mababang antas ng GA sa mga panlabas na layer ng SAM, ngunit ipinakita na sila ay nakataas sa gitna at sa mga hangganan ng SAM (Larawan 4e at Karagdagang Fig. 9a, c). Iminumungkahi nito na ang GA ay ipinamamahagi din sa SAM na may spatial na pattern na maihahambing sa ipinahayag ng qmRGA. Bilang isang pantulong na diskarte, itinuring din namin ang SAM na may fluorescent na GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl lamang bilang isang negatibong kontrol. Ang Fl signal ay ipinamahagi sa buong SAM, kabilang ang gitnang rehiyon at primordium, kahit na sa isang mas mababang intensity (Larawan 4j at Karagdagang Fig. 10d). Sa kaibahan, ang lahat ng tatlong GA-Fl ay partikular na naipon sa loob ng primordium na mga hangganan at sa iba't ibang antas sa natitirang bahagi ng IPR, kasama ang GA7-Fl na naipon sa pinakamalaking domain sa IPR (Larawan 4k at Karagdagang Fig. 10a,b). Ang dami ng fluorescence intensity ay nagsiwalat na ang IPR sa non-IPR intensity ratio ay mas mataas sa GA-Fl-treated SAM kumpara sa Fl-treated SAM (Fig. 4l at Supplementary Fig. 10c). Magkasama, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang GA ay naroroon sa mas mataas na konsentrasyon sa mga cell ng IPR na matatagpuan pinakamalapit sa hangganan ng organ. Iminumungkahi nito na ang pattern ng aktibidad ng pagsenyas ng SAM GA ay nagreresulta mula sa parehong pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng mga receptor ng GA at pagkakaiba-iba ng akumulasyon ng GA sa mga cell ng IPR malapit sa mga hangganan ng organ. Kaya, ang aming pagsusuri ay nagsiwalat ng isang hindi inaasahang spatiotemporal pattern ng GA signaling, na may mas mababang aktibidad sa gitna at primordium ng SAM at mas mataas na aktibidad sa IPR sa peripheral na rehiyon.
Upang maunawaan ang papel ng pagkakaiba-iba ng aktibidad ng senyas ng GA sa SAM, sinuri namin ang ugnayan sa pagitan ng aktibidad ng senyas ng GA, pagpapalawak ng cell, at paghahati ng cell gamit ang real-time na time-lapse imaging ng SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dahil sa papel ng GA sa regulasyon ng paglago, inaasahan ang isang positibong ugnayan sa mga parameter ng pagpapalawak ng cell. Samakatuwid, inihambing muna namin ang mga mapa ng aktibidad ng pagsenyas ng GA na may mga mapa ng rate ng paglaki ng ibabaw ng cell (bilang isang proxy para sa lakas ng pagpapalawak ng cell para sa isang naibigay na cell at para sa mga cell ng anak na babae sa dibisyon) at sa mga mapa ng anisotropy ng paglago, na sumusukat sa direksyon ng pagpapalawak ng cell (ginagamit din dito para sa isang naibigay na cell at para sa mga cell ng anak na babae sa dibisyon; Fig. 5a, b, tingnan ang Mga Paraan at Mga Karagdagang Paraan). Ang aming mga mapa ng SAM cell surface growth rate ay pare-pareho sa mga nakaraang obserbasyon38,39, na may kaunting mga rate ng paglago sa hangganan at pinakamataas na rate ng paglago sa pagbuo ng mga bulaklak (Fig. 5a). Ang pangunahing pagsusuri ng sangkap (PCA) ay nagpakita na ang aktibidad ng senyas ng GA ay negatibong nakakaugnay sa intensity ng paglaki ng ibabaw ng cell (Larawan 5c). Ipinakita rin namin na ang mga pangunahing axes ng pagkakaiba-iba, kabilang ang input ng senyas ng GA at intensity ng paglago, ay orthogonal sa direksyon na tinutukoy ng mataas na expression ng CLV3, na nagpapatunay sa pagbubukod ng mga cell mula sa sentro ng SAM sa natitirang mga pagsusuri. Kinumpirma ng pagsusuri ng ugnayan ng Spearman ang mga resulta ng PCA (Larawan 5d), na nagpapahiwatig na ang mas mataas na mga signal ng GA sa IPR ay hindi nagresulta sa mas mataas na pagpapalawak ng cell. Gayunpaman, ang pagsusuri ng ugnayan ay nagsiwalat ng isang bahagyang positibong ugnayan sa pagitan ng aktibidad ng senyas ng GA at anisotropy ng paglago (Larawan 5c, d), na nagmumungkahi na ang mas mataas na senyas ng GA sa IPR ay nakakaimpluwensya sa direksyon ng paglaki ng cell at posibleng posisyon ng eroplano ng cell division.
a, b Ang mga mapa ng init ng ibig sabihin ng paglaki ng ibabaw (a) at paglago anisotropy (b) sa SAM ay nag-average sa pitong independyenteng halaman (ginamit bilang mga proxies para sa lakas at direksyon ng pagpapalawak ng cell, ayon sa pagkakabanggit). Kasama sa pagsusuri ng c PCA ang mga sumusunod na variable: signal ng GA, intensity ng paglaki ng ibabaw, anisotropy ng paglaki sa ibabaw, at expression ng CLV3. Ang bahagi ng PCA 1 ay pangunahing negatibong nakakaugnay sa intensity ng paglago ng ibabaw at positibong nakakaugnay sa signal ng GA. Ang bahagi ng PCA 2 ay higit sa lahat ay positibong nakakaugnay sa paglaki ng ibabaw na anisotropy at negatibong nakakaugnay sa pagpapahayag ng CLV3. Ang mga porsyento ay kumakatawan sa pagkakaiba-iba na ipinaliwanag ng bawat bahagi. d Spearman correlation analysis sa pagitan ng GA signal, surface growth intensity, at surface growth anisotropy sa tissue scale hindi kasama ang CZ. Ang numero sa kanan ay ang halaga ng Spearman rho sa pagitan ng dalawang variable. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga kaso kung saan ang ugnayan/negatibong ugnayan ay lubos na makabuluhan. e 3D visualization ng Col-0 SAM L1 cells sa pamamagitan ng confocal microscopy. Ang mga bagong cell wall na nabuo sa SAM (ngunit hindi ang primordium) sa 10 h ay kinukulayan ayon sa kanilang mga halaga ng anggulo. Ang color bar ay ipinapakita sa kanang sulok sa ibaba. Ipinapakita ng inset ang kaukulang 3D na imahe sa 0 h. Ang eksperimento ay naulit ng dalawang beses na may katulad na mga resulta. f Ang mga box plot ay nagpapakita ng mga rate ng cell division sa IPR at non-IPR Col-0 SAM (n = 10 independyenteng halaman). Ipinapakita ng gitnang linya ang median, at ang mga hangganan ng kahon ay nagpapahiwatig ng ika-25 at ika-75 na porsyento. Ang mga whisker ay nagpapahiwatig ng minimum at maximum na mga halaga na tinutukoy gamit ang R software. Ang mga halaga ng P ay nakuha gamit ang two-tailed t-test ng Welch. g, h Schematic diagram na nagpapakita (g) kung paano sukatin ang anggulo ng bagong cell wall (magenta) na may paggalang sa radial na direksyon mula sa gitna ng SAM (white dotted line) (tanging mga acute angle value, ibig sabihin, 0–90°, ang isinasaalang-alang), at (h) ang circumferential/lateral at radial na direksyon sa loob ng meristem. i Frequency histograms ng cell division plane orientation sa buong SAM (dark blue), IPR (medium blue), at non-IPR (light blue), ayon sa pagkakabanggit. Ang mga halaga ng P ay nakuha sa pamamagitan ng isang two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. Ang eksperimento ay naulit ng dalawang beses na may katulad na mga resulta. j Frequency histograms ng cell division plane orientation ng IPR sa paligid ng P3 (light green), P4 (medium green), at P5 (dark green), ayon sa pagkakabanggit. Ang mga halaga ng P ay nakuha sa pamamagitan ng isang two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. Ang eksperimento ay naulit ng dalawang beses na may katulad na mga resulta.
Samakatuwid, susunod naming sinisiyasat ang ugnayan sa pagitan ng senyas ng GA at aktibidad ng cell division sa pamamagitan ng pagkilala sa mga bagong nabuong cell wall sa panahon ng assay (Fig. 5e). Ang diskarte na ito ay nagpapahintulot sa amin na sukatin ang dalas at direksyon ng paghahati ng cell. Nakakagulat, nalaman namin na ang dalas ng mga paghahati ng cell sa IPR at ang natitirang bahagi ng SAM (non-IPR, Fig. 5f) ay magkatulad, na nagpapahiwatig na ang mga pagkakaiba sa pagsenyas ng GA sa pagitan ng IPR at non-IPR na mga cell ay hindi nakakaapekto nang malaki sa cell division. Ito, at ang positibong ugnayan sa pagitan ng pagsenyas ng GA at anisotropy ng paglago, ay nag-udyok sa amin na isaalang-alang kung ang aktibidad ng senyas ng GA ay maaaring makaimpluwensya sa oryentasyon ng eroplano ng cell division. Sinusukat namin ang oryentasyon ng bagong cell wall bilang isang talamak na anggulo na may kaugnayan sa radial axis na nagkokonekta sa meristem center at sa gitna ng bagong cell wall (Larawan 5e-i) at naobserbahan ang isang malinaw na tendensya para sa mga cell na hatiin sa mga anggulo na malapit sa 90 ° na may kaugnayan sa radial axis, na may pinakamataas na frequency na sinusunod sa 703-80 ° (203-80%) (203-80%). (22.62%) (Larawan 5e,i), na tumutugma sa mga dibisyon ng cell sa circumferential/transverse na direksyon (Larawan 5h). Upang suriin ang kontribusyon ng pagsenyas ng GA sa pag-uugali ng cell division na ito, sinuri namin ang mga parameter ng cell division sa IPR at non-IPR nang hiwalay (Fig. 5i). Napansin namin na ang pamamahagi ng anggulo ng paghahati sa mga cell ng IPR ay naiiba mula sa mga non-IPR cells o sa mga cell sa buong SAM, na may mga cell ng IPR na nagpapakita ng isang mas mataas na proporsyon ng mga lateral / circular cell division, ibig sabihin, 70-80 ° at 80-90 ° (33.86% at 30.71%, ayon sa pagkakabanggit, kaukulang mga proporsyon). Kaya, ang aming mga obserbasyon ay nagsiwalat ng kaugnayan sa pagitan ng mataas na GA signaling at isang cell division plane orientation na malapit sa circumferential na direksyon, katulad ng ugnayan sa pagitan ng GA signaling activity at growth anisotropy (Fig. 5c, d). Upang higit pang maitatag ang spatial conservation ng asosasyong ito, sinukat namin ang division plane orientation sa mga cell ng IPR na nakapalibot sa primordium simula sa P3, dahil ang pinakamataas na aktibidad ng pagsenyas ng GA ay nakita sa rehiyong ito simula sa P4 (Fig. 4). Ang mga anggulo ng paghahati ng IPR sa paligid ng P3 at P4 ay nagpakita ng walang makabuluhang pagkakaiba sa istatistika, kahit na ang pagtaas ng dalas ng mga lateral cell division ay naobserbahan sa IPR sa paligid ng P4 (Larawan 5j). Gayunpaman, sa mga cell ng IPR sa paligid ng P5, ang pagkakaiba sa oryentasyon ng eroplano ng cell division ay naging makabuluhan sa istatistika, na may matinding pagtaas sa dalas ng mga transverse cell division (Larawan 5j). Sama-sama, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang pagsenyas ng GA ay maaaring makontrol ang oryentasyon ng mga dibisyon ng cell sa SAM, na naaayon sa mga nakaraang ulat40, 41 na ang mataas na senyas ng GA ay maaaring mag-udyok ng lateral orientation ng mga cell division sa IPR.
Ito ay hinuhulaan na ang mga cell sa IPR ay hindi isasama sa primordia ngunit sa halip sa internodes2,42,43. Ang transverse orientation ng mga cell division sa IPR ay maaaring magresulta sa tipikal na organisasyon ng mga parallel longitudinal row ng epidermal cells sa internodes. Ang aming mga obserbasyon na inilarawan sa itaas ay nagmumungkahi na ang GA signaling ay malamang na gumaganap ng isang papel sa prosesong ito sa pamamagitan ng pag-regulate ng direksyon ng cell division.
Ang pagkawala ng function ng ilang DELLA genes ay nagreresulta sa isang constitutive GA response, at ang mga della mutant ay maaaring gamitin upang subukan ang hypothesis na ito44. Una naming sinuri ang mga pattern ng expression ng limang DELLA gen sa SAM. Ang transkripsyon na pagsasanib ng linya ng GUS45 ay nagsiwalat na ang GAI, RGA, RGL1, at RGL2 (sa mas kaunting lawak) ay ipinahayag sa SAM (Karagdagang Fig. 11a–d). Sa situ hybridization karagdagang ipinakita na GAI mRNA accumulates partikular sa primordia at pagbuo ng mga bulaklak (Karagdagang Fig. 11e). Ang RGL1 at RGL3 mRNA ay nakita sa buong SAM canopy at sa mga mas lumang bulaklak, samantalang ang RGL2 mRNA ay mas sagana sa rehiyon ng hangganan (Karagdagang Fig. 11f–h). Confocal imaging ng pRGL3 :: RGL3-GFP SAM ay nakumpirma ang expression na sinusunod ng in situ hybridization at ipinakita na ang RGL3 protein ay naipon sa gitnang bahagi ng SAM (Karagdagang Fig. 11i). Gamit ang linya ng pRGA :: GFP-RGA, nalaman din namin na ang protina ng RGA ay nag-iipon sa SAM, ngunit ang kasaganaan nito ay bumababa sa hangganan simula sa P4 (Karagdagang Fig. 11j). Kapansin-pansin, ang mga pattern ng expression ng RGL3 at RGA ay pare-pareho sa mas mataas na aktibidad ng senyas ng GA sa IPR, tulad ng nakita ng qmRGA (Fig. 4). Bukod dito, ang mga data na ito ay nagpapahiwatig na ang lahat ng mga DELLA ay ipinahayag sa SAM at ang kanilang ekspresyon ay sama-samang sumasaklaw sa buong SAM.
Susunod naming sinuri ang mga parameter ng cell division sa wild-type na SAM (Ler, control) at ang gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). Kapansin-pansin, napansin namin ang isang makabuluhang pagbabago sa istatistika sa pamamahagi ng mga frequency ng anggulo ng cell division sa della global mutant SAM kumpara sa wild type (Fig. 6c). Ang pagbabagong ito sa della global mutant ay dahil sa pagtaas ng dalas ng 80–90° na mga anggulo (34.71% kumpara sa 24.55%) at, sa mas mababang lawak, 70–80° na mga anggulo (23.78% kumpara sa 20.18%), ibig sabihin, naaayon sa mga transverse cell division (Larawan 6c). Ang dalas ng mga di-transverse na dibisyon (0–60°) ay mas mababa din sa della global mutant (Larawan 6c). Ang dalas ng mga transverse cell division ay makabuluhang nadagdagan sa SAM ng della global mutant (Larawan 6b). Ang dalas ng transverse cell division sa IPR ay mas mataas din sa della global mutant kumpara sa wild type (Fig. 6d). Sa labas ng rehiyon ng IPR, ang ligaw na uri ay may mas pare-parehong pamamahagi ng mga anggulo ng paghahati ng cell, samantalang ang della global mutant ay ginusto ang mga tangential division tulad ng IPR (Fig. 6e). Binibilang din namin ang oryentasyon ng mga dibisyon ng cell sa SAM ng ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, at ga2ox6-2), isang GA-inactive mutant background kung saan nag-iipon ang GA. Alinsunod sa pagtaas ng mga antas ng GA, ang SAM ng quintuple ga2ox mutant inflorescence ay mas malaki kaysa sa Col-0 (Karagdagang Fig. 12a, b), at kung ikukumpara sa Col-0, ang quintuple ga2ox SAM ay nagpakita ng kakaibang pamamahagi ng mga anggulo ng paghahati ng cell, na ang dalas ng anggulo ay tumataas mula 50°ing, mahalagang paghahati muli. 12a–c). Kaya, ipinapakita namin na ang constitutive activation ng GA signaling at akumulasyon ng GA ay nag-uudyok sa mga lateral cell division sa IPR at ang natitirang bahagi ng SAM.
a, b 3D visualization ng L1 layer ng PI-stained Ler (a) at global della mutant (b) SAM gamit ang confocal microscopy. Ang mga bagong cell wall na nabuo sa SAM (ngunit hindi ang primordium) sa loob ng 10-h na panahon ay ipinapakita at kinulayan ayon sa kanilang mga halaga ng anggulo. Ipinapakita ng inset ang SAM sa 0 h. Ang color bar ay ipinapakita sa kanang sulok sa ibaba. Ang arrow sa (b) ay tumuturo sa isang halimbawa ng mga nakahanay na cell file sa global della mutant. Ang eksperimento ay naulit ng dalawang beses na may katulad na mga resulta. ce paghahambing ng frequency distribution ng cell division plane orientations sa buong SAM (d), IPR (e), at non-IPR (f) sa pagitan ng Ler at global della. Ang mga halaga ng P ay nakuha gamit ang isang two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. f, g 3D visualization ng confocal na mga larawan ng PI-stained SAM ng Col-0 (i) at pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenic na mga halaman. Ang mga panel (a, b) ay nagpapakita ng mga bagong cell wall (ngunit hindi primordia) na nabuo sa SAM sa loob ng 10 h. Ang eksperimento ay naulit ng dalawang beses na may katulad na mga resulta. h–j Paghahambing ng frequency distribution ng cell division plane orientations na matatagpuan sa buong SAM (h), IPR (i) at non-IPR (j) sa pagitan ng Col-0 at pCUC2::gai-1-VENUS na mga halaman. Ang mga halaga ng P ay nakuha gamit ang isang two-tailed Kolmogorov-Smirnov test.
Susunod naming sinubukan ang epekto ng pagpigil sa pagsenyas ng GA partikular sa IPR. Sa layuning ito, ginamit namin ang tagataguyod ng cotyledon cup 2 (CUC2) upang himukin ang pagpapahayag ng isang nangingibabaw na negatibong gai-1 na protina na pinagsama sa VENUS (sa linya ng pCUC2::gai-1-VENUS). Sa wild-type na SAM, ang CUC2 promoter ay nagtutulak ng pagpapahayag ng karamihan sa mga IPR sa SAM, kabilang ang mga border cells, mula P4 pataas, at ang katulad na tiyak na expression ay naobserbahan sa pCUC2::gai-1-VENUS na mga halaman (tingnan sa ibaba). Ang pamamahagi ng mga anggulo ng cell division sa kabuuan ng SAM o IPR ng pCUC2 :: gai-1-VENUS na mga halaman ay hindi gaanong naiiba sa ligaw na uri, bagaman sa hindi inaasahang pagkakataon ay natagpuan namin na ang mga cell na walang IPR sa mga halaman na ito ay nahahati sa mas mataas na dalas ng 80-90 ° (Fig. 6f-j).
Iminungkahi na ang direksyon ng paghahati ng cell ay nakasalalay sa geometry ng SAM, lalo na ang tensile stress na nabuo ng tissue curvature46. Kaya tinanong namin kung ang hugis ng SAM ay binago sa della global mutant at pCUC2::gai-1-VENUS na mga halaman. Tulad ng iniulat dati12, ang laki ng della global mutant SAM ay mas malaki kaysa sa ligaw na uri (Karagdagang Fig. 13a, b, d). In situ hybridization ng CLV3 at STM RNA ay kinumpirma ang pagpapalawak ng meristem sa della mutants at higit pang ipinakita ang lateral expansion ng stem cell niche (Karagdagang Fig. 13e, f, h, i). Gayunpaman, ang curvature ng SAM ay magkapareho sa parehong genotypes (Karagdagang Fig. 13k, m, n, p). Napansin namin ang isang katulad na pagtaas sa laki sa gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant na walang pagbabago sa curvature kumpara sa wild type (Karagdagang Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Ang dalas ng orientation ng cell division ay naapektuhan din sa della quadruple mutant, ngunit sa mas mababang lawak kaysa sa della monolithic mutant (Karagdagang Fig. 12d–f). Ang epekto ng dosis na ito, kasama ang kawalan ng epekto sa curvature, ay nagmumungkahi na ang natitirang aktibidad ng RGL3 sa Della quadruple mutant ay nililimitahan ang mga pagbabago sa oryentasyon ng cell division na sanhi ng pagkawala ng aktibidad ng DELLA at ang mga pagbabago sa mga lateral cell division ay nangyayari bilang tugon sa mga pagbabago sa aktibidad ng pagsenyas ng GA kaysa sa mga pagbabago sa geometry ng SAM. Tulad ng inilarawan sa itaas, ang tagataguyod ng CUC2 ay nagtutulak ng pagpapahayag ng IPR sa SAM na nagsisimula sa P4 (Karagdagang Fig. 14a, b), at sa kabaligtaran, ang pCUC2::gai-1-VENUS SAM ay may pinababang laki ngunit mas mataas na curvature (Karagdagang Fig. 14c–h). Ang pagbabagong ito sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology ay maaaring magresulta sa ibang distribusyon ng mga mechanical stress kumpara sa wild type, kung saan ang matataas na circumferential stress ay nagsisimula sa mas maikling distansya mula sa SAM center47. Bilang kahalili, ang mga pagbabago sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM morpolohiya ay maaaring magresulta mula sa mga pagbabago sa mga rehiyonal na mekanikal na katangian na sapilitan ng transgene expression48. Sa parehong mga kaso, maaari itong bahagyang i-offset ang mga epekto ng mga pagbabago sa pagsenyas ng GA sa pamamagitan ng pagtaas ng posibilidad na mahahati ang mga cell sa circumferential/transverse na oryentasyon, na nagpapaliwanag sa aming mga obserbasyon.
Kung pinagsama-sama, kinumpirma ng aming data na ang mas mataas na senyas ng GA ay gumaganap ng isang aktibong papel sa lateral na oryentasyon ng cell division plane sa IPR. Ipinakikita rin nila na ang meristem curvature ay nakakaimpluwensya rin sa oryentasyon ng cell division plane sa IPR.
Ang transverse orientation ng division plane sa IPR, dahil sa mataas na GA signaling activity, ay nagmumungkahi na ang GA ay paunang nag-organisa ng isang radial cell file sa epidermis sa loob ng SAM upang tukuyin ang cellular na organisasyon na makikita mamaya sa epidermal internode. Sa katunayan, ang mga naturang cell file ay madalas na nakikita sa mga imahe ng SAM ng della global mutants (Larawan 6b). Kaya, upang higit pang tuklasin ang pag-andar ng pag-unlad ng spatial pattern ng GA signaling sa SAM, ginamit namin ang time-lapse imaging upang pag-aralan ang spatial na organisasyon ng mga cell sa IPR sa wild-type (Ler at Col-0), della global mutants, at pCUC2 :: gai-1-VENUS transgenic na mga halaman.
Natagpuan namin na ipinakita ng qmRGA na ang aktibidad ng pagbibigay ng senyas ng GA sa IPR ay tumaas mula sa P1/P2 at umakyat sa P4, at ang pattern na ito ay nanatiling pare-pareho sa paglipas ng panahon (Larawan 4a–f at Karagdagang Fig. 8c–f, k). Upang pag-aralan ang spatial na organisasyon ng mga cell sa IPR na may pagtaas ng signal ng GA, nilagyan namin ng label ang mga cell ng Ler IPR sa itaas at sa mga gilid ng P4 ayon sa kanilang kapalaran sa pag-unlad na nasuri 34 h pagkatapos ng unang pagmamasid, ibig sabihin, higit sa dalawang beses na plastid, na nagpapahintulot sa amin na sundin ang mga cell ng IPR sa panahon ng pag-unlad ng primordium mula P1/P2 hanggang P4. Gumamit kami ng tatlong magkakaibang kulay: dilaw para sa mga cell na iyon na isinama sa primordium malapit sa P4, berde para sa mga nasa IPR, at purple para sa mga lumahok sa parehong proseso (Larawan 7a–c). Sa t0 (0 h), 1-2 layer ng IPR cells ang makikita sa harap ng P4 (Larawan 7a). Tulad ng inaasahan, kapag nahati ang mga cell na ito, ginawa nila ito higit sa lahat sa pamamagitan ng transverse division plane (Fig. 7a–c). Ang mga katulad na resulta ay nakuha gamit ang Col-0 SAM (nakatuon sa P3, na ang hangganan ay nakatiklop na katulad ng P4 sa Ler), bagaman sa genotype na ito ang fold na nabuo sa floral border ay mas mabilis na itinago ang mga cell ng IPR (Larawan 7g–i). Kaya, ang pattern ng paghahati ng mga cell ng IPR ay paunang inaayos ang mga cell sa mga hilera ng radial, tulad ng sa mga internode. Ang organisasyon ng mga hilera ng radial at ang lokalisasyon ng mga cell ng IPR sa pagitan ng magkakasunod na mga organo ay nagmumungkahi na ang mga cell na ito ay mga internodal progenitor.
Dito, bumuo kami ng ratiometric GA signaling biosensor, qmRGA, na nagbibigay-daan sa quantitative mapping ng GA signaling activity na nagreresulta mula sa pinagsamang GA at GA receptor concentrations habang pinapaliit ang interference sa endogenous signaling pathways, at sa gayon ay nagbibigay ng impormasyon sa GA function sa cellular level. Sa layuning ito, gumawa kami ng binagong DELLA protein, mRGA, na nawalan ng kakayahang magbigkis sa mga kasosyo sa pakikipag-ugnayan ng DELLA ngunit nananatiling sensitibo sa GA-induced proteolysis. Tumutugon ang qmRGA sa parehong mga exogenous at endogenous na pagbabago sa mga antas ng GA, at ang mga dynamic na katangian ng sensing nito ay nagbibigay-daan sa pagtatasa ng mga spatiotemporal na pagbabago sa aktibidad ng pagsenyas ng GA sa panahon ng pag-unlad. Ang qmRGA ay isa ring napaka-flexible na tool dahil maaari itong iakma sa iba't ibang mga tisyu sa pamamagitan ng pagpapalit ng promoter na ginamit para sa pagpapahayag nito (kung kinakailangan), at dahil sa konserbadong katangian ng GA signaling pathway at ang PFYRE motif sa mga angiosperms, malamang na mailipat ito sa ibang mga species22. Alinsunod dito, ang isang katumbas na mutation sa bigas na SLR1 DELLA protein (HYY497AAA) ay ipinakita din upang sugpuin ang aktibidad ng growth repressor ng SLR1 habang bahagyang binabawasan ang GA-mediated degradation nito, katulad ng mRGA23. Kapansin-pansin, ang mga kamakailang pag-aaral sa Arabidopsis ay nagpakita na ang isang solong amino acid mutation sa PFYRE domain (S474L) ay binago ang aktibidad ng transkripsyon ng RGA nang hindi naaapektuhan ang kakayahang makipag-ugnay sa mga kasosyo sa transcription factor50. Bagaman ang mutation na ito ay napakalapit sa 3 mga pagpapalit ng amino acid na naroroon sa mRGA, ipinapakita ng aming mga pag-aaral na ang dalawang mutasyon na ito ay nagbabago ng mga natatanging katangian ng DELLA. Bagama't ang karamihan sa mga kasosyo sa transcription factor ay nagbubuklod sa mga domain ng LHR1 at SAW ng DELLA26,51, maaaring makatulong ang ilang conserved amino acid sa domain ng PFYRE na patatagin ang mga pakikipag-ugnayang ito.
Ang pagbuo ng internode ay isang pangunahing katangian sa arkitektura ng halaman at pagpapabuti ng ani. Inihayag ng qmRGA ang mas mataas na aktibidad ng senyas ng GA sa mga cell ng progenitor ng IPR internode. Sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng quantitative imaging at genetics, ipinakita namin na ang mga pattern ng senyas ng GA ay nagpapatong ng mga circular/transverse cell division na eroplano sa SAM epidermis, na humuhubog sa organisasyon ng cell division na kinakailangan para sa pag-unlad ng internode. Maraming mga regulator ng oryentasyon ng eroplano ng cell division ay nakilala sa panahon ng pag-unlad52,53. Nagbibigay ang aming trabaho ng malinaw na halimbawa kung paano kinokontrol ng aktibidad ng pagsenyas ng GA ang cellular parameter na ito. Ang DELLA ay maaaring makipag-ugnayan sa prefolding protein complexes41, kaya ang GA signaling ay maaaring mag-regulate ng cell division plane orientation sa pamamagitan ng direktang pag-impluwensya sa cortical microtubule orientation40,41,54,55. Hindi namin inaasahang ipinakita na sa SAM, ang pagkakaugnay ng mas mataas na aktibidad ng senyas ng GA ay hindi pagpapahaba o paghahati ng cell, ngunit anisotropy lamang ang paglago, na naaayon sa isang direktang epekto ng GA sa direksyon ng cell division sa IPR. Gayunpaman, hindi namin maibubukod na ang epektong ito ay maaari ding hindi direkta, halimbawa ay pinagsama ng GA-induced cell wall softening56. Ang mga pagbabago sa mga katangian ng cell wall ay nag-uudyok sa mekanikal na stress57,58, na maaari ring maimpluwensyahan ang oryentasyon ng cell division plane sa pamamagitan ng pag-apekto sa oryentasyon ng cortical microtubule39,46,59. Ang pinagsamang mga epekto ng GA-induced mechanical stress at direktang regulasyon ng microtubule orientation ng GA ay maaaring kasangkot sa pagbuo ng isang tiyak na pattern ng cell division orientation sa IPR upang tukuyin ang mga internode, at kailangan ng karagdagang pag-aaral upang subukan ang ideyang ito. Katulad nito, ang mga nakaraang pag-aaral ay na-highlight ang kahalagahan ng DELLA-interacting proteins TCP14 at 15 sa kontrol ng internode formation60, 61 at ang mga salik na ito ay maaaring mamagitan sa pagkilos ng GA kasama ang BREVIPEDICELLUS (BP) at PENNYWISE (PNY), na kumokontrol sa pag-unlad ng internode at ipinakita na nakakaimpluwensya sa pagsenyas ng GA2, 62. Dahil ang mga DELLA ay nakikipag-ugnayan sa mga brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, at abscisic acid (ABA) signaling pathways63,64 at na ang mga hormone na ito ay maaaring makaimpluwensya sa microtubule orientation65, ang mga epekto ng GA sa cell division orientation ay maaari ding ipamagitan ng ibang mga hormone.
Ang mga unang pag-aaral sa cytological ay nagpakita na ang parehong panloob at panlabas na mga rehiyon ng Arabidopsis SAM ay kinakailangan para sa pag-unlad ng internode2, 42. Ang katotohanan na aktibong kinokontrol ng GA ang paghahati ng cell sa mga panloob na tisyu12 ay sumusuporta sa isang dual function ng GA sa pag-regulate ng meristem at laki ng internode sa SAM. Ang pattern ng directional cell division ay mahigpit ding kinokontrol sa inner SAM tissue, at ang regulasyong ito ay mahalaga para sa stem growth52. Magiging kagiliw-giliw na suriin kung ang GA ay gumaganap din ng isang papel sa pag-orient sa cell division plane sa panloob na organisasyon ng SAM, at sa gayon ay na-synchronize ang detalye at pagbuo ng mga internode sa loob ng SAM.
Ang mga halaman ay lumago sa vitro sa lupa o 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) na dinagdagan ng 1% sucrose at 1% agar (Sigma) sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon (16 h light, 22 °C), maliban sa hypocotyl at root growth na mga eksperimento kung saan ang mga punla ay lumaki sa vertical plate sa ilalim ng pare-parehong liwanag at 22 °C. Para sa mga eksperimento ng nitrate, ang mga halaman ay lumaki sa binagong MS medium (bioWORLD plant medium) na dinagdagan ng sapat na nitrate (0 o 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose at 1% A-agar (Sigma) sa ilalim ng mahabang araw na mga kondisyon.
Ang GID1a cDNA na ipinasok sa pDONR221 ay muling pinagsama sa pDONR P4-P1R-pUBQ10 at pDONR P2R-P3-mCherry sa pB7m34GW upang makabuo ng pUBQ10::GID1a-mCherry. Ang IDD2 DNA na ipinasok sa pDONR221 ay muling pinagsama sa pB7RWG266 upang makabuo ng p35S:IDD2-RFP. Upang makabuo ng pGID1b::2xmTQ2-GID1b, isang 3.9 kb fragment upstream ng GID1b coding region at isang 4.7 kb fragment na naglalaman ng GID1b cDNA (1.3 kb) at terminator (3.4 kb) ay unang pinalaki gamit ang mga primer sa PRrmo at pagkatapos ay ipinasok ang PNR4 na Talahanayan 3. Fisher Scientific) at pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ayon sa pagkakabanggit, at sa wakas ay muling pinagsama sa pDONR221 2xmTQ268 sa pGreen 012567 target vector gamit ang Gateway cloning. Upang makabuo ng pCUC2::LSSmOrange, ang CUC2 promoter sequence (3229 bp upstream ng ATG) na sinusundan ng coding sequence ng malaking Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 na may N7 nuclear localization signal at ang NOS transcriptional terminator ay na-assemble sa pGreenment recombining vector system gamit ang Gateway-targeting na vector. (Invitrogen). Ang planta binary vector ay ipinakilala sa Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 at ipinakilala sa Nicotiana benthamiana leaves sa pamamagitan ng Agrobacterium infiltration method at sa Arabidopsis thaliana Col-0 sa pamamagitan ng floral dip method, ayon sa pagkakabanggit. Ang pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry at pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ay nahiwalay sa mga F3 at F1 na progenies ng kani-kanilang mga krus, ayon sa pagkakabanggit.
Ang RNA in situ hybridization ay isinagawa sa humigit-kumulang 1 cm ang haba ng shoot tips72, na nakolekta at agad na naayos sa FAA solution (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) na paunang pinalamig sa 4 °C. Pagkatapos ng 2 × 15 min na mga paggamot sa vacuum, ang fixative ay binago at ang mga sample ay natupok nang magdamag. Ang mga GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, at RGL3 cDNA at mga antisense probes sa kanilang mga 3′-UTR ay na-synthesize gamit ang mga primer na ipinakita sa Pandagdag na Talahanayan 3 tulad ng inilarawan ni Rosier et al.73. Ang mga probes na may label na digoxigenin ay immunodetected gamit ang digoxigenin antibodies (3000-fold dilution; Roche, numero ng catalog: 11 093 274 910), at ang mga seksyon ay nabahiran ng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-folduble tetrafold,BT250/nitrobluetrafold)2. pagbabanto) solusyon.
Oras ng post: Peb-10-2025