Ang paglaki ng apical meristem (SAM) ng usbong ay mahalaga para sa arkitektura ng tangkay. Mga hormone ng halamanmga gibberelinAng mga (GA) ay gumaganap ng mahahalagang papel sa pag-coordinate ng paglaki ng halaman, ngunit ang kanilang papel sa SAM ay nananatiling hindi gaanong nauunawaan. Dito, bumuo kami ng isang ratiometric biosensor ng GA signaling sa pamamagitan ng pag-engineer ng DELLA protein upang sugpuin ang mahalagang regulatory function nito sa GA transcriptional response habang pinapanatili ang degradation nito sa pagkilala ng GA. Ipinakita namin na ang degradation-based biosensor na ito ay tumpak na nagtatala ng mga pagbabago sa mga antas ng GA at cellular sensing habang umuunlad. Ginamit namin ang biosensor na ito upang i-map ang aktibidad ng GA signaling sa SAM. Ipinapakita namin na ang mataas na GA signal ay naroroon pangunahin sa mga cell na matatagpuan sa pagitan ng organ primordia, na mga precursor sa mga internode cell. Gamit ang gain- at loss-of-function approach, higit pa naming ipinapakita na kinokontrol ng GA ang oryentasyon ng cell division plane, na nagtatatag ng canonical cellular organization ng mga internode, sa gayon ay nagtataguyod ng internode specification sa SAM.
Ang shoot apical meristem (SAM), na matatagpuan sa tuktok ng shoot, ay naglalaman ng isang niche ng mga stem cell na ang aktibidad ay bumubuo ng mga lateral organ at stem node sa isang modular at iterative na paraan sa buong buhay ng halaman. Ang bawat isa sa mga paulit-ulit na yunit na ito, o mga plant node, ay kinabibilangan ng mga internode at lateral organ sa mga node, at mga axillary meristem sa mga axil ng dahon1. Ang paglaki at organisasyon ng mga plant node ay nagbabago sa panahon ng pag-unlad. Sa Arabidopsis, ang internodal growth ay pinipigilan sa panahon ng vegetative stage, at ang mga axillary meristem ay nananatiling dormant sa mga axil ng mga dahon ng rosette. Sa panahon ng paglipat sa floral phase, ang SAM ay nagiging inflorescence meristem, na bumubuo ng mga pahabang internode at axillary buds, mga branchlet sa mga axil ng mga dahon ng cauline, at kalaunan, mga walang dahon na bulaklak2. Bagama't nakagawa tayo ng makabuluhang pag-unlad sa pag-unawa sa mga mekanismo na kumokontrol sa pagsisimula ng mga dahon, bulaklak, at sanga, medyo kaunti ang nalalaman tungkol sa kung paano lumilitaw ang mga internode.
Ang pag-unawa sa spatiotemporal na distribusyon ng mga GA ay makakatulong upang mas maunawaan ang mga tungkulin ng mga hormone na ito sa iba't ibang tisyu at sa iba't ibang yugto ng pag-unlad. Ang biswalisasyon ng pagkasira ng RGA-GFP fusion na ipinahayag sa ilalim ng aksyon ng sarili nitong promoter ay nagbibigay ng mahalagang impormasyon sa regulasyon ng kabuuang antas ng GA sa mga ugat15,16. Gayunpaman, ang ekspresyon ng RGA ay nag-iiba sa iba't ibang tisyu17 at kinokontrol ng GA18. Kaya, ang magkakaibang ekspresyon ng RGA promoter ay maaaring magresulta sa fluorescence pattern na naobserbahan sa RGA-GFP at sa gayon ang pamamaraang ito ay hindi quantitative. Kamakailan lamang, ang bioactive fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 ay nagsiwalat ng akumulasyon ng GA sa root endocortex at ang regulasyon ng mga antas ng cellular nito sa pamamagitan ng GA transport. Kamakailan lamang, ipinakita ng GA FRET sensor nlsGPS1 na ang mga antas ng GA ay nauugnay sa paghaba ng cell sa mga ugat, filament, at mga dark-grown hypocotyls21. Gayunpaman, tulad ng nakita natin, ang konsentrasyon ng GA ay hindi lamang ang parameter na kumokontrol sa aktibidad ng pagbibigay ng senyas ng GA, dahil nakasalalay ito sa mga kumplikadong proseso ng sensing. Dito, batay sa aming pag-unawa sa mga pathway ng DELLA at GA signaling, iniuulat namin ang pag-unlad at paglalarawan ng isang degradation-based ratiometric biosensor para sa GA signaling. Upang mabuo ang quantitative biosensor na ito, gumamit kami ng isang mutant GA-sensitive RGA na isinama sa isang fluorescent protein at ubiquitous expressed sa mga tisyu, pati na rin ang isang GA-insensitive fluorescent protein. Ipinapakita namin na ang mutant RGA protein fusions ay hindi nakakasagabal sa endogenous GA signaling kapag ubiquitous expressed, at ang biosensor na ito ay maaaring masukat ang signaling activity na nagreresulta mula sa parehong GA input at GA signal processing ng sensing apparatus na may mataas na spatiotemporal resolution. Ginamit namin ang biosensor na ito upang i-map ang spatiotemporal distribution ng GA signaling activity at sukatin kung paano kinokontrol ng GA ang cellular behavior sa SAM epidermis. Ipinapakita namin na kinokontrol ng GA ang oryentasyon ng division plane ng mga SAM cell na matatagpuan sa pagitan ng organ primordia, sa gayon ay tinutukoy ang canonical cellular organization ng internode.
Panghuli, tinanong namin kung ang qmRGA ay maaaring mag-ulat ng mga pagbabago sa endogenous na antas ng GA gamit ang lumalaking hypocotyls. Ipinakita namin dati na ang nitrate ay nagpapasigla sa paglaki sa pamamagitan ng pagtaas ng synthesis ng GA at, kaugnay nito, ang degradasyon ng DELLA34. Alinsunod dito, naobserbahan namin na ang haba ng hypocotyl sa mga punla ng pUBQ10::qmRGA na lumaki sa ilalim ng masaganang suplay ng nitrate (10 mM NO3−) ay mas mahaba nang malaki kaysa sa mga punla na lumaki sa ilalim ng mga kondisyon na kulang sa nitrate (Karagdagang Fig. 6a). Kasabay ng tugon sa paglaki, ang mga signal ng GA ay mas mataas sa mga hypocotyl ng mga punla na lumaki sa ilalim ng mga kondisyon na kulang sa nitrate na 10 mM NO3− kaysa sa mga punla na lumaki nang walang nitrate (Karagdagang Fig. 6b, c). Kaya, ang qmRGA ay nagbibigay-daan din sa pagsubaybay sa mga pagbabago sa signaling ng GA na dulot ng mga endogenous na pagbabago sa konsentrasyon ng GA.
Upang maunawaan kung ang aktibidad ng GA signaling na natukoy ng qmRGA ay nakadepende sa konsentrasyon ng GA at persepsyon ng GA, gaya ng inaasahan batay sa disenyo ng sensor, sinuri namin ang ekspresyon ng tatlong GID1 receptor sa mga vegetative at reproductive tissues. Sa mga punla, ipinakita ng GID1-GUS reporter line na ang GID1a at c ay mataas ang ekspresyon sa mga cotyledon (Fig. 3a–c). Bukod pa rito, ang lahat ng tatlong receptor ay ipinahayag sa mga dahon, lateral root primordia, mga dulo ng ugat (maliban sa root cap ng GID1b), at sa vascular system (Fig. 3a–c). Sa inflorescence SAM, nakita namin ang mga GUS signal para lamang sa GID1b at 1c (Karagdagang Fig. 7a–c). Kinumpirma ng in situ hybridization ang mga pattern ng ekspresyon na ito at higit pang ipinakita na ang GID1c ay pantay na ipinahayag sa mababang antas sa SAM, samantalang ang GID1b ay nagpakita ng mas mataas na ekspresyon sa paligid ng SAM (Karagdagang Fig. 7d–l). Ang pGID1b::2xmTQ2-GID1b translational fusion ay nagpakita rin ng graded range ng GID1b expression, mula sa mababa o walang expression sa gitna ng SAM hanggang sa mataas na expression sa mga organ border (Supplementary Fig. 7m). Kaya naman, ang mga GID1 receptor ay hindi pantay na naipamahagi sa loob at sa loob ng mga tissue. Sa mga kasunod na eksperimento, naobserbahan din namin na ang overexpression ng GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ay nagpataas ng sensitivity ng qmRGA sa mga hypocotyl sa external GA application (Fig. 3d, e). Sa kabaligtaran, ang fluorescence na sinukat ng qd17mRGA sa hypocotyl ay hindi sensitibo sa GA3 treatment (Fig. 3f, g). Para sa parehong assay, ang mga punla ay ginamot na may mataas na konsentrasyon ng GA (100 μM GA3) upang masuri ang mabilis na pag-uugali ng sensor, kung saan ang kakayahang magbigkis sa GID1 receptor ay pinahusay o nawala. Sama-sama, kinukumpirma ng mga resultang ito na ang qmRGA biosensor ay nagsisilbing pinagsamang tungkulin bilang isang GA at GA sensor, at nagmumungkahi na ang magkakaibang ekspresyon ng GID1 receptor ay maaaring makabuluhang mag-modulate sa emissivity ng sensor.
Sa ngayon, ang distribusyon ng mga GA signal sa SAM ay nananatiling hindi malinaw. Samakatuwid, ginamit namin ang mga halamang nagpapahayag ng qmRGA at ang pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 upang kalkulahin ang mga high-resolution quantitative maps ng aktibidad ng GA signaling, na nakatuon sa L1 layer (epidermis; Fig. 4a, b, tingnan ang Methods at Supplementary Methods), dahil ang L1 ay gumaganap ng mahalagang papel sa pagkontrol sa paglaki ng SAM36. Dito, ang ekspresyon ng pCLV3::mCherry-NLS ay nagbigay ng isang nakapirming geometric reference point para sa pagsusuri ng spatiotemporal distribution ng aktibidad ng GA signaling37. Bagama't ang GA ay itinuturing na mahalaga para sa lateral organ development4, naobserbahan namin na ang mga GA signal ay mababa sa floral primordium (P) simula sa yugto ng P3 (Fig. 4a, b), samantalang ang mga batang P1 at P2 primordium ay may katamtamang aktibidad na katulad ng sa gitnang rehiyon (Fig. 4a, b). Mas mataas na aktibidad ng GA signaling ang natukoy sa mga hangganan ng organ primordium, simula sa P1/P2 (sa mga gilid ng hangganan) at umabot sa peak sa P4, pati na rin sa lahat ng mga selula ng peripheral region na matatagpuan sa pagitan ng primordia (Fig. 4a, b at Supplementary Fig. 8a, b). Ang mas mataas na aktibidad ng GA signaling na ito ay naobserbahan hindi lamang sa epidermis kundi pati na rin sa L2 at itaas na mga layer ng L3 (Supplementary Fig. 8b). Ang pattern ng mga signal ng GA na natukoy sa SAM gamit ang qmRGA ay nanatiling hindi nagbabago sa paglipas ng panahon (Supplementary Fig. 8c–f, k). Bagama't ang qd17mRGA construct ay sistematikong ibinaba sa SAM ng mga halamang T3 mula sa limang independiyenteng linya na aming inilarawan nang detalyado, nagawa naming suriin ang mga pattern ng fluorescence na nakuha gamit ang pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP construct (Supplementary Fig. 8g–j, l). Sa control line na ito, maliliit na pagbabago lamang sa fluorescence ratio ang natukoy sa SAM, ngunit sa sentro ng SAM ay naobserbahan namin ang isang malinaw at hindi inaasahang pagbaba sa VENUS na nauugnay sa TagBFP. Kinukumpirma nito na ang signaling pattern na naobserbahan ng qmRGA ay sumasalamin sa GA-dependent degradation ng mRGA-VENUS, ngunit ipinapakita rin nito na maaaring labis na tantiyahin ng qmRGA ang aktibidad ng GA signaling sa meristem center. Sa buod, ipinapakita ng aming mga resulta ang isang GA signaling pattern na pangunahing sumasalamin sa distribusyon ng primordia. Ang distribusyon na ito ng inter-primordial region (IPR) ay dahil sa unti-unting pagtatatag ng mataas na aktibidad ng GA signaling sa pagitan ng umuunlad na primordium at ng gitnang rehiyon, habang kasabay nito ay bumababa ang aktibidad ng GA signaling sa primordium (Fig. 4c, d).
Ang distribusyon ng mga receptor ng GID1b at GID1c (tingnan sa itaas) ay nagmumungkahi na ang magkakaibang ekspresyon ng mga receptor ng GA ay nakakatulong sa paghubog ng pattern ng aktibidad ng pagbibigay ng senyas ng GA sa SAM. Inisip namin kung ang magkakaibang akumulasyon ng GA ay maaaring kasangkot. Upang siyasatin ang posibilidad na ito, ginamit namin ang nlsGPS1 GA FRET sensor21. Natukoy ang pagtaas ng dalas ng pag-activate sa SAM ng nlsGPS1 na ginagamot ng 10 μM GA4+7 sa loob ng 100 minuto (Karagdagang Fig. 9a–e), na nagpapahiwatig na ang nlsGPS1 ay tumutugon sa mga pagbabago sa konsentrasyon ng GA sa SAM, tulad ng ginagawa nito sa mga ugat21. Ang spatial distribution ng nlsGPS1 activation frequency ay nagpakita ng medyo mababang antas ng GA sa mga panlabas na layer ng SAM, ngunit ipinakita na ang mga ito ay nakataas sa gitna at sa mga hangganan ng SAM (Fig. 4e at Supplementary Fig. 9a,c). Ipinahihiwatig nito na ang GA ay ipinamamahagi rin sa SAM na may spatial pattern na maihahambing sa ipinakita ng qmRGA. Bilang komplementaryong pamamaraan, ginamit din namin ang fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl lamang bilang negatibong kontrol para sa SAM. Ang Fl signal ay naipamahagi sa buong SAM, kabilang ang gitnang rehiyon at primordium, bagama't mas mababa ang intensidad (Fig. 4j at Supplementary Fig. 10d). Sa kabaligtaran, ang lahat ng tatlong GA-Fl ay partikular na naipon sa loob ng mga hangganan ng primordium at sa iba't ibang antas sa natitirang bahagi ng IPR, kung saan ang GA7-Fl ay naipon sa pinakamalaking domain sa IPR (Fig. 4k at Supplementary Fig. 10a,b). Ang pagkuwantipika ng intensidad ng fluorescence ay nagsiwalat na ang intensity ratio ng IPR sa non-IPR ay mas mataas sa GA-Fl-treated SAM kumpara sa Fl-treated SAM (Fig. 4l at Supplementary Fig. 10c). Sama-sama, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang GA ay nasa mas mataas na konsentrasyon sa mga IPR cell na pinakamalapit sa hangganan ng organ. Ipinahihiwatig nito na ang pattern ng aktibidad ng pagbibigay ng senyas ng SAM GA ay resulta ng parehong magkakaibang ekspresyon ng mga receptor ng GA at magkakaibang akumulasyon ng GA sa mga IPR cell malapit sa mga hangganan ng organ. Kaya naman, ang aming pagsusuri ay nagsiwalat ng isang hindi inaasahang spatiotemporal pattern ng GA signaling, na may mas mababang aktibidad sa gitna at primordium ng SAM at mas mataas na aktibidad sa IPR sa peripheral na rehiyon.
Upang maunawaan ang papel ng differential GA signaling activity sa SAM, sinuri namin ang ugnayan sa pagitan ng GA signaling activity, cell expansion, at cell division gamit ang real-time time-lapse imaging ng SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dahil sa papel ng GA sa growth regulation, inaasahang positibong ugnayan sa mga cell expansion parameter. Samakatuwid, una naming inihambing ang mga mapa ng GA signaling activity sa mga mapa ng cell surface growth rate (bilang proxy para sa lakas ng cell expansion para sa isang partikular na cell at para sa mga daughter cell sa division) at sa mga mapa ng growth anisotropy, na sumusukat sa directionality ng cell expansion (ginagamit din dito para sa isang partikular na cell at para sa mga daughter cell sa division; Fig. 5a,b, tingnan ang Methods at Supplementary Methods). Ang aming mga mapa ng SAM cell surface growth rate ay naaayon sa mga nakaraang obserbasyon38,39, na may minimal growth rates sa border at maximal growth rates sa mga umuunlad na bulaklak (Fig. 5a). Ipinakita ng principal component analysis (PCA) na ang GA signaling activity ay negatibong nauugnay sa intensity ng cell surface growth (Figure 5c). Ipinakita rin namin na ang mga pangunahing axes of variation, kabilang ang GA signaling input at growth intensity, ay orthogonal sa direksyong tinutukoy ng mataas na CLV3 expression, na nagpapatunay sa pagbubukod ng mga cell mula sa SAM center sa mga natitirang pagsusuri. Kinumpirma ng Spearman correlation analysis ang mga resulta ng PCA (Figure 5d), na nagpapahiwatig na ang mas mataas na GA signal sa IPR ay hindi nagresulta sa mas mataas na cell expansion. Gayunpaman, ang correlation analysis ay nagpakita ng bahagyang positibong ugnayan sa pagitan ng GA signaling activity at growth anisotropy (Figure 5c, d), na nagmumungkahi na ang mas mataas na GA signaling sa IPR ay nakakaimpluwensya sa direksyon ng paglaki ng cell at posibleng sa posisyon ng cell division plane.
a, b Mga mapa ng init ng mean surface growth (a) at growth anisotropy (b) sa SAM na na-average sa pitong independiyenteng halaman (ginamit bilang mga proxy para sa lakas at direksyon ng paglawak ng cell, ayon sa pagkakabanggit). c Kasama sa pagsusuri ng PCA ang mga sumusunod na baryabol: GA signal, surface growth intensity, surface growth anisotropy, at CLV3 expression. Ang PCA component 1 ay pangunahing negatibong nauugnay sa surface growth intensity at positibong nauugnay sa GA signal. Ang PCA component 2 ay pangunahing positibong nauugnay sa surface growth anisotropy at negatibong nauugnay sa CLV3 expression. Ang mga porsyento ay kumakatawan sa pagkakaiba-iba na ipinaliwanag ng bawat component. d Spearman correlation analysis sa pagitan ng GA signal, surface growth intensity, at surface growth anisotropy sa tissue scale hindi kasama ang CZ. Ang numero sa kanan ay ang halaga ng Spearman rho sa pagitan ng dalawang baryabol. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga kaso kung saan ang correlation/negative correlation ay lubos na makabuluhan. e 3D visualization ng mga Col-0 SAM L1 cells sa pamamagitan ng confocal microscopy. Ang mga bagong cell wall na nabuo sa SAM (ngunit hindi ang primordium) sa 10 oras ay kinulayan ayon sa kanilang mga halaga ng anggulo. Ang color bar ay ipinapakita sa ibabang kanang sulok. Ipinapakita ng inset ang katumbas na 3D na imahe sa 0 oras. Ang eksperimento ay inulit nang dalawang beses na may magkatulad na resulta. f Ipinapakita ng mga box plot ang mga rate ng paghahati ng cell sa IPR at non-IPR Col-0 SAM (n = 10 independent plant). Ipinapakita ng center line ang median, at ipinapakita ng mga box boundaries ang ika-25 at ika-75 percentile. Ipinapahiwatig ng mga whisker ang minimum at maximum na mga halaga na natukoy gamit ang R software. Ang mga P value ay nakuha gamit ang Welch's two-tailed t-test. g, h Schematic diagram na nagpapakita ng (g) kung paano sukatin ang anggulo ng bagong cell wall (magenta) kaugnay ng radial direction mula sa gitna ng SAM (puting tuldok-tuldok na linya) (tanging ang mga acute angle value, ibig sabihin, 0–90°, ang isinasaalang-alang), at (h) ang circumferential/lateral at radial directions sa loob ng meristem. i Mga frequency histogram ng oryentasyon ng plane ng paghahati ng cell sa buong SAM (dark blue), IPR (medium blue), at non-IPR (light blue), ayon sa pagkakabanggit. Ang mga P value ay nakuha sa pamamagitan ng two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. Ang eksperimento ay inulit nang dalawang beses na may magkatulad na resulta. j Mga frequency histogram ng oryentasyon ng cell division plane ng IPR sa paligid ng P3 (light green), P4 (medium green), at P5 (dark green), ayon sa pagkakabanggit. Ang mga P value ay nakuha sa pamamagitan ng two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. Ang eksperimento ay inulit nang dalawang beses na may magkatulad na resulta.
Samakatuwid, sinundan namin ng pagsisiyasat ang ugnayan sa pagitan ng GA signaling at aktibidad ng cell division sa pamamagitan ng pagtukoy sa mga bagong nabuo na cell wall sa panahon ng assay (Fig. 5e). Ang pamamaraang ito ay nagbigay-daan sa amin upang masukat ang dalas at direksyon ng cell division. Nakakagulat na natuklasan namin na ang dalas ng mga cell division sa IPR at sa iba pang bahagi ng SAM (non-IPR, Fig. 5f) ay magkatulad, na nagpapahiwatig na ang mga pagkakaiba sa GA signaling sa pagitan ng IPR at non-IPR cells ay hindi makabuluhang nakakaapekto sa cell division. Ito, at ang positibong ugnayan sa pagitan ng GA signaling at growth anisotropy, ang nag-udyok sa amin na isaalang-alang kung ang aktibidad ng GA signaling ay maaaring makaimpluwensya sa oryentasyon ng cell division plane. Sinukat namin ang oryentasyon ng bagong cell wall bilang isang acute angle na may kaugnayan sa radial axis na nagdudugtong sa meristem center at sa sentro ng bagong cell wall (Fig. 5e-i) at naobserbahan ang isang malinaw na tendensiya para sa mga cell na hatiin sa mga anggulong malapit sa 90° kung ihahambing sa radial axis, kung saan ang pinakamataas na frequency ay naobserbahan sa 70–80° (23.28%) at 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), na tumutugma sa mga cell division sa circumferential/transverse direction (Fig. 5h). Upang masuri ang kontribusyon ng GA signaling sa pag-uugali ng cell division na ito, sinuri namin ang mga parameter ng cell division sa IPR at non-IPR nang hiwalay (Fig. 5i). Naobserbahan namin na ang distribusyon ng anggulo ng paghahati sa mga selula ng IPR ay naiiba sa mga selulang hindi IPR o sa mga selula sa buong SAM, kung saan ang mga selula ng IPR ay nagpapakita ng mas mataas na proporsyon ng mga lateral/circular cell division, ibig sabihin, 70–80° at 80–90° (33.86% at 30.71%, ayon sa pagkakabanggit, katumbas na proporsyon) (Fig. 5i). Kaya, ang aming mga obserbasyon ay nagpakita ng kaugnayan sa pagitan ng mataas na GA signaling at isang oryentasyon ng cell division plane na malapit sa circumferential direction, katulad ng ugnayan sa pagitan ng aktibidad ng GA signaling at growth anisotropy (Fig. 5c, d). Upang higit pang maitatag ang spatial conservation ng kaugnayang ito, sinukat namin ang oryentasyon ng division plane sa mga selula ng IPR na nakapalibot sa primordium simula sa P3, dahil ang pinakamataas na aktibidad ng GA signaling ay nakita sa rehiyong ito simula sa P4 (Fig. 4). Ang mga anggulo ng paghahati ng IPR sa paligid ng P3 at P4 ay hindi nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa istatistika, bagaman ang pagtaas ng dalas ng mga lateral cell division ay naobserbahan sa IPR sa paligid ng P4 (Fig. 5j). Gayunpaman, sa mga selula ng IPR sa paligid ng P5, ang pagkakaiba sa oryentasyon ng eroplano ng paghahati ng selula ay naging makabuluhan sa istatistika, na may matinding pagtaas sa dalas ng mga transverse cell division (Fig. 5j). Sama-sama, iminumungkahi ng mga resultang ito na kayang kontrolin ng GA signaling ang oryentasyon ng mga paghahati ng selula sa SAM, na naaayon sa mga naunang ulat40,41 na ang mataas na GA signaling ay maaaring magdulot ng lateral orientation ng mga paghahati ng selula sa IPR.
Hinuhulaan na ang mga selula sa IPR ay hindi isasama sa primordia kundi sa mga internode2,42,43. Ang transverse orientation ng mga cell division sa IPR ay maaaring magresulta sa tipikal na organisasyon ng mga parallel longitudinal rows ng mga epidermal cell sa mga internode. Ang aming mga obserbasyon na inilarawan sa itaas ay nagmumungkahi na ang GA signaling ay malamang na gumaganap ng isang papel sa prosesong ito sa pamamagitan ng pag-regulate sa direksyon ng cell division.
Ang pagkawala ng tungkulin ng ilang gene ng DELLA ay nagreresulta sa isang constitutive GA response, at ang mga della mutant ay maaaring gamitin upang subukan ang hypothesis na ito44. Una naming sinuri ang mga pattern ng ekspresyon ng limang gene ng DELLA sa SAM. Ang transcriptional fusion ng GUS line45 ay nagsiwalat na ang GAI, RGA, RGL1, at RGL2 (sa mas mababang lawak) ay naipahayag sa SAM (Supplementary Fig. 11a–d). Ang in situ hybridization ay lalong nagpakita na ang GAI mRNA ay partikular na naiipon sa primordia at mga umuunlad na bulaklak (Supplementary Fig. 11e). Ang RGL1 at RGL3 mRNA ay nakita sa buong canopy ng SAM at sa mga mas lumang bulaklak, samantalang ang RGL2 mRNA ay mas sagana sa border region (Supplementary Fig. 11f–h). Kinumpirma ng confocal imaging ng pRGL3::RGL3-GFP SAM ang ekspresyong naobserbahan ng in situ hybridization at ipinakita na ang protina ng RGL3 ay naiipon sa gitnang bahagi ng SAM (Supplementary Fig. 11i). Gamit ang linyang pRGA::GFP-RGA, natuklasan din namin na ang protina ng RGA ay naiipon sa SAM, ngunit ang kasaganaan nito ay bumababa sa hangganan simula sa P4 (Karagdagang Larawan 11j). Kapansin-pansin, ang mga pattern ng ekspresyon ng RGL3 at RGA ay naaayon sa mas mataas na aktibidad ng pagbibigay ng senyas ng GA sa IPR, gaya ng natukoy ng qmRGA (Larawan 4). Bukod dito, ipinapahiwatig ng mga datos na ito na ang lahat ng DELLA ay ipinapahayag sa SAM at ang kanilang ekspresyon ay sama-samang sumasaklaw sa buong SAM.
Sumunod naming sinuri ang mga parameter ng paghahati ng selula sa wild-type na SAM (Ler, control) at ang gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). Kapansin-pansin, naobserbahan namin ang isang makabuluhang pagbabago sa distribusyon ng mga frequency ng anggulo ng paghahati ng selula sa della global mutant na SAM kumpara sa wild type (Fig. 6c). Ang pagbabagong ito sa della global mutant ay dahil sa pagtaas ng frequency ng 80–90° na anggulo (34.71% vs. 24.55%) at, sa mas mababang antas, 70–80° na anggulo (23.78% vs. 20.18%), ibig sabihin, naaayon sa transverse cell divisions (Fig. 6c). Ang frequency ng mga non-transverse divisions (0–60°) ay mas mababa rin sa della global mutant (Fig. 6c). Ang frequency ng transverse cell divisions ay tumaas nang malaki sa SAM ng della global mutant (Fig. 6b). Mas mataas din ang dalas ng transverse cell divisions sa IPR sa della global mutant kumpara sa wild type (Fig. 6d). Sa labas ng rehiyon ng IPR, ang wild type ay may mas pare-parehong distribusyon ng mga anggulo ng cell division, samantalang mas gusto ng della global mutant ang tangential divisions tulad ng IPR (Fig. 6e). Tinantiya rin namin ang oryentasyon ng mga cell divisions sa SAM ng ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, at ga2ox6-2), isang GA-inactive mutant background kung saan naiipon ang GA. Kasabay ng pagtaas ng mga antas ng GA, ang SAM ng quintuple ga2ox mutant inflorescence ay mas malaki kaysa sa Col-0 (Karagdagang Larawan 12a, b), at kumpara sa Col-0, ang quintuple ga2ox SAM ay nagpakita ng kakaibang distribusyon ng mga anggulo ng paghahati ng cell, kung saan ang dalas ng anggulo ay tumataas mula 50° hanggang 90°, ibig sabihin, muli ay pinapaboran ang mga tangential division (Karagdagang Larawan 12a–c). Kaya, ipinapakita namin na ang constitutive activation ng GA signaling at GA accumulation ay nagdudulot ng lateral cell divisions sa IPR at sa iba pang bahagi ng SAM.
a, b 3D visualization ng L1 layer ng PI-stained Ler (a) at global della mutant (b) SAM gamit ang confocal microscopy. Ang mga bagong cell wall na nabuo sa SAM (ngunit hindi ang primordium) sa loob ng 10 oras ay ipinapakita at kinulayan ayon sa kanilang mga halaga ng anggulo. Ipinapakita ng inset ang SAM sa 0 oras. Ang color bar ay ipinapakita sa kanang sulok sa ibaba. Ang arrow sa (b) ay tumuturo sa isang halimbawa ng mga nakahanay na cell file sa global della mutant. Ang eksperimento ay inulit nang dalawang beses na may magkatulad na mga resulta. paghahambing ng frequency distribution ng mga oryentasyon ng cell division plane sa buong SAM (d), IPR (e), at non-IPR (f) sa pagitan ng Ler at global della. Ang mga P value ay nakuha gamit ang isang two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. f, g 3D visualization ng mga confocal na imahe ng PI-stained SAM ng Col-0 (i) at pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenic na mga halaman. Ang mga panel (a, b) ay nagpapakita ng mga bagong cell wall (ngunit hindi ang primordia) na nabuo sa SAM sa loob ng 10 oras. Ang eksperimento ay inulit nang dalawang beses na may magkatulad na resulta. h–j Paghahambing ng frequency distribution ng mga oryentasyon ng cell division plane na matatagpuan sa buong SAM (h), IPR (i) at non-IPR (j) sa pagitan ng mga halamang Col-0 at pCUC2::gai-1-VENUS. Ang mga P value ay nakuha gamit ang isang two-tailed Kolmogorov–Smirnov test.
Sumunod naming sinubukan ang epekto ng pagpigil sa GA signaling partikular sa IPR. Para dito, ginamit namin ang cotyledon cup 2 (CUC2) promoter upang himukin ang ekspresyon ng isang dominanteng negatibong gai-1 protein na isinama sa VENUS (sa linya ng pCUC2::gai-1-VENUS). Sa wild-type na SAM, ang CUC2 promoter ang nagtutulak sa ekspresyon ng karamihan sa mga IPR sa SAM, kabilang ang mga border cell, mula P4 pataas, at ang katulad na partikular na ekspresyon ay naobserbahan sa mga halamang pCUC2::gai-1-VENUS (tingnan sa ibaba). Ang distribusyon ng mga anggulo ng paghahati ng cell sa buong SAM o IPR ng mga halamang pCUC2::gai-1-VENUS ay hindi makabuluhang naiiba sa wild type, bagaman hindi inaasahan na natuklasan namin na ang mga cell na walang IPR sa mga halamang ito ay nahahati sa mas mataas na frequency na 80–90° (Fig. 6f–j).
Iminungkahi na ang direksyon ng paghahati ng selula ay nakadepende sa heometriya ng SAM, partikular na ang tensile stress na nalikha ng tissue curvature46. Kaya naman tinanong namin kung nabago ang hugis ng SAM sa mga halamang della global mutant at pCUC2::gai-1-VENUS. Gaya ng naiulat dati12, ang laki ng della global mutant na SAM ay mas malaki kaysa sa wild type (Supplementary Fig. 13a, b, d). Kinumpirma ng in situ hybridization ng CLV3 at STM RNA ang paglawak ng meristem sa mga della mutant at ipinakita pa ang lateral expansion ng stem cell niche (Supplementary Fig. 13e, f, h, i). Gayunpaman, ang SAM curvature ay magkatulad sa parehong genotype (Supplementary Fig. 13k, m, n, p). Naobserbahan namin ang katulad na pagtaas sa laki sa gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant nang walang pagbabago sa curvature kumpara sa wild type (Supplementary Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Ang dalas ng oryentasyon ng paghahati ng selula ay naapektuhan din sa della quadruple mutant, ngunit sa mas mababang antas kaysa sa della monolithic mutant (Karagdagang Larawan 12d–f). Ang epekto ng dosis na ito, kasama ang kawalan ng epekto sa kurbada, ay nagmumungkahi na ang natitirang aktibidad ng RGL3 sa Della quadruple mutant ay naglilimita sa mga pagbabago sa oryentasyon ng paghahati ng selula na dulot ng pagkawala ng aktibidad ng DELLA at ang mga pagbabago sa mga lateral cell division ay nangyayari bilang tugon sa mga pagbabago sa aktibidad ng GA signaling sa halip na mga pagbabago sa geometry ng SAM. Gaya ng inilarawan sa itaas, ang CUC2 promoter ang nagtutulak sa ekspresyon ng IPR sa SAM simula sa P4 (Karagdagang Larawan 14a, b), at sa kabaligtaran, ang pCUC2::gai-1-VENUS SAM ay may pinababang laki ngunit mas mataas na kurbada (Karagdagang Larawan 14c–h). Ang pagbabagong ito sa morpolohiya ng pCUC2::gai-1-VENUS SAM ay maaaring magresulta sa ibang distribusyon ng mga mechanical stress kumpara sa wild type, kung saan ang mataas na circumferential stress ay nagsisimula sa mas maikling distansya mula sa sentro ng SAM47. Bilang kahalili, ang mga pagbabago sa morpolohiya ng pCUC2::gai-1-VENUS SAM ay maaaring resulta ng mga pagbabago sa mga rehiyonal na mekanikal na katangian na dulot ng transgene expression48. Sa parehong mga kaso, maaari nitong bahagyang mabawi ang mga epekto ng mga pagbabago sa GA signaling sa pamamagitan ng pagtaas ng posibilidad na ang mga selula ay hatiin sa circumferential/transverse orientation, na nagpapaliwanag sa aming mga obserbasyon.
Kung pagsasama-samahin, kinukumpirma ng aming datos na ang mas mataas na GA signaling ay may aktibong papel sa lateral orientation ng cell division plane sa IPR. Ipinapakita rin nila na ang meristem curvature ay nakakaimpluwensya rin sa oryentasyon ng cell division plane sa IPR.
Ang transverse orientation ng division plane sa IPR, dahil sa mataas na aktibidad ng GA signaling, ay nagmumungkahi na ang GA ay nag-oorganisa ng isang radial cell file sa epidermis sa loob ng SAM upang tukuyin ang cellular organization na matatagpuan sa epidermal internode. Sa katunayan, ang mga naturang cell file ay madalas na nakikita sa mga imahe ng SAM ng mga della global mutant (Fig. 6b). Kaya, upang higit pang tuklasin ang developmental function ng spatial pattern ng GA signaling sa SAM, gumamit kami ng time-lapse imaging upang suriin ang spatial organization ng mga cell sa IPR sa wild-type (Ler at Col-0), della global mutants, at pCUC2::gai-1-VENUS transgenic plants.
Natuklasan namin na ipinakita ng qmRGA na ang aktibidad ng GA signaling sa IPR ay tumaas mula sa P1/P2 at umabot sa pinakamataas na antas sa P4, at ang pattern na ito ay nanatiling pare-pareho sa paglipas ng panahon (Fig. 4a–f at Supplementary Fig. 8c–f, k). Upang masuri ang spatial organization ng mga cell sa IPR na may tumataas na signal ng GA, nilagyan namin ng label ang mga cell ng Ler IPR sa itaas at sa mga gilid ng P4 ayon sa kanilang developmental fate na sinuri 34 oras pagkatapos ng unang obserbasyon, ibig sabihin, higit sa dalawang beses na plastid, na nagpapahintulot sa amin na sundan ang mga cell ng IPR habang umuunlad ang primordium mula P1/P2 hanggang P4. Gumamit kami ng tatlong magkakaibang kulay: dilaw para sa mga cell na isinama sa primordium malapit sa P4, berde para sa mga nasa IPR, at lila para sa mga lumahok sa parehong proseso (Fig. 7a–c). Sa t0 (0 h), 1–2 layer ng mga cell ng IPR ang nakikita sa harap ng P4 (Fig. 7a). Gaya ng inaasahan, nang hatiin ang mga cell na ito, ginawa nila ito pangunahin sa pamamagitan ng transverse division plane (Figs. 7a–c). Nakamit ang mga katulad na resulta gamit ang Col-0 SAM (na nakatuon sa P3, na ang hangganan ay natitiklop nang katulad ng P4 sa Ler), bagama't sa genotype na ito, ang fold na nabuo sa floral border ay mas mabilis na nagtago sa mga IPR cell (Fig. 7g–i). Kaya, ang pattern ng paghahati ng mga IPR cell ay paunang nag-oorganisa sa mga cell sa mga radial row, tulad ng sa mga internode. Ang organisasyon ng mga radial row at ang lokalisasyon ng mga IPR cell sa pagitan ng magkakasunod na organo ay nagmumungkahi na ang mga cell na ito ay mga internodal progenitor.
Dito, bumuo kami ng isang ratiometric GA signaling biosensor, qmRGA, na nagbibigay-daan sa quantitative mapping ng aktibidad ng GA signaling na nagreresulta mula sa pinagsamang konsentrasyon ng GA at GA receptor habang binabawasan ang interference sa endogenous signaling pathways, sa gayon ay nagbibigay ng impormasyon sa function ng GA sa antas ng cellular. Para dito, bumuo kami ng isang binagong DELLA protein, mRGA, na nawalan ng kakayahang magbigkis sa mga interaction partner ng DELLA ngunit nananatiling sensitibo sa GA-induced proteolysis. Ang qmRGA ay tumutugon sa parehong exogenous at endogenous na mga pagbabago sa mga antas ng GA, at ang mga dynamic sensing properties nito ay nagbibigay-daan sa pagtatasa ng spatiotemporal na mga pagbabago sa aktibidad ng GA signaling habang nag-develop. Ang qmRGA ay isa ring napaka-flexible na tool dahil maaari itong iakma sa iba't ibang tissues sa pamamagitan ng pagpapalit ng promoter na ginagamit para sa expression nito (kung kinakailangan), at dahil sa conserved nature ng GA signaling pathway at ang PFYRE motif sa mga angiosperms, malamang na mailipat ito sa ibang species22. Kasabay nito, isang katumbas na mutasyon sa protina ng bigas na SLR1 DELLA (HYY497AAA) ang ipinakita rin na pumipigil sa aktibidad ng pagpigil sa paglago ng SLR1 habang bahagyang binabawasan lamang ang degradasyon nito na namamagitan sa GA, katulad ng mRGA23. Kapansin-pansin, ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral sa Arabidopsis na ang isang mutasyon ng amino acid sa PFYRE domain (S474L) ay nagpabago sa aktibidad ng transkripsyon ng RGA nang hindi naaapektuhan ang kakayahan nitong makipag-ugnayan sa mga kasosyo sa transcription factor50. Bagama't ang mutasyon na ito ay napakalapit sa 3 pagpapalit ng amino acid na nasa mRGA, ipinapakita ng aming mga pag-aaral na ang dalawang mutasyon na ito ay nagpapabago sa magkakaibang katangian ng DELLA. Bagama't karamihan sa mga kasosyo sa transcription factor ay nagbibigkis sa mga domain ng LHR1 at SAW ng DELLA26,51, ang ilang nakonserbang amino acid sa PFYRE domain ay maaaring makatulong na patatagin ang mga interaksyong ito.
Ang pag-unlad ng internode ay isang mahalagang katangian sa arkitektura ng halaman at pagpapabuti ng ani. Ang qmRGA ay nagpakita ng mas mataas na aktibidad ng GA signaling sa mga IPR internode progenitor cells. Sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng quantitative imaging at genetics, ipinakita namin na ang mga pattern ng GA signaling ay nagpapatong-patong sa mga circular/transverse cell division planes sa SAM epidermis, na humuhubog sa organisasyon ng cell division na kinakailangan para sa pag-unlad ng internode. Ilang regulator ng oryentasyon ng cell division plane ang natukoy sa panahon ng pag-unlad52,53. Ang aming trabaho ay nagbibigay ng isang malinaw na halimbawa kung paano kinokontrol ng aktibidad ng GA signaling ang cellular parameter na ito. Ang DELLA ay maaaring makipag-ugnayan sa mga prefolding protein complexes41, kaya maaaring i-regulate ng GA signaling ang oryentasyon ng cell division plane sa pamamagitan ng direktang pag-impluwensya sa cortical microtubule orientation40,41,54,55. Hindi inaasahan naming ipinakita na sa SAM, ang correlate ng mas mataas na aktibidad ng GA signaling ay hindi ang cell elongation o division, kundi ang growth anisotropy lamang, na naaayon sa direktang epekto ng GA sa direksyon ng cell division sa IPR. Gayunpaman, hindi namin maaaring ibukod na ang epektong ito ay maaari ring hindi direkta, halimbawa na namamagitan sa pamamagitan ng GA-induced cell wall softening56. Ang mga pagbabago sa mga katangian ng cell wall ay nagdudulot ng mechanical stress57,58, na maaari ring makaimpluwensya sa oryentasyon ng cell division plane sa pamamagitan ng pag-apekto sa oryentasyon ng cortical microtubule39,46,59. Ang pinagsamang epekto ng GA-induced mechanical stress at direktang regulasyon ng microtubule orientation ng GA ay maaaring kasangkot sa pagbuo ng isang partikular na pattern ng cell division orientation sa IPR upang tukuyin ang mga internode, at kinakailangan ang mga karagdagang pag-aaral upang masubukan ang ideyang ito. Katulad nito, binigyang-diin ng mga nakaraang pag-aaral ang kahalagahan ng mga DELLA-interacting protein na TCP14 at 15 sa pagkontrol ng pagbuo ng internode60,61 at ang mga salik na ito ay maaaring mamagitan sa aksyon ng GA kasama ang BREVIPEDICELLUS (BP) at PENNYWISE (PNY), na kumokontrol sa pag-unlad ng internode at naipakita na nakakaimpluwensya sa GA signaling2,62. Dahil ang mga DELLA ay nakikipag-ugnayan sa mga brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, at abscisic acid (ABA) signaling pathways63,64 at ang mga hormone na ito ay maaaring makaimpluwensya sa oryentasyon ng microtubule65, ang mga epekto ng GA sa oryentasyon ng paghahati ng cell ay maaari ring namamagitan sa iba pang mga hormone.
Ipinakita ng mga naunang pag-aaral sa cytology na ang parehong panloob at panlabas na mga rehiyon ng Arabidopsis SAM ay kinakailangan para sa pag-unlad ng internode2,42. Ang katotohanan na ang GA ay aktibong nagreregula ng paghahati ng cell sa mga panloob na tisyu12 ay sumusuporta sa dalawahang tungkulin ng GA sa pagreregula ng laki ng meristem at internode sa SAM. Ang pattern ng directional cell division ay mahigpit ding kinokontrol sa panloob na tisyu ng SAM, at ang regulasyong ito ay mahalaga para sa paglaki ng tangkay52. Magiging interesante na suriin kung ang GA ay gumaganap din ng papel sa pag-oorden ng plane ng paghahati ng cell sa panloob na organisasyon ng SAM, sa gayon ay isinasabay ang detalye at pag-unlad ng mga internode sa loob ng SAM.
Ang mga halaman ay pinatubo nang in vitro sa lupa o 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) na dinagdagan ng 1% sucrose at 1% agar (Sigma) sa ilalim ng mga karaniwang kondisyon (16 oras na liwanag, 22 °C), maliban sa mga eksperimento sa hypocotyl at paglaki ng ugat kung saan ang mga punla ay pinatubo sa mga patayong plato sa ilalim ng palaging liwanag at 22 °C. Para sa mga eksperimento sa nitrate, ang mga halaman ay pinatubo sa binagong MS medium (bioWORLD plant medium) na dinagdagan ng sapat na nitrate (0 o 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose at 1% A-agar (Sigma) sa ilalim ng mga kondisyong pangmatagalan.
Ang GID1a cDNA na ipinasok sa pDONR221 ay muling pinagsama sa pDONR P4-P1R-pUBQ10 at pDONR P2R-P3-mCherry sa pB7m34GW upang makabuo ng pUBQ10::GID1a-mCherry. Ang IDD2 DNA na ipinasok sa pDONR221 ay muling pinagsama sa pB7RWG266 upang makabuo ng p35S:IDD2-RFP. Upang makabuo ng pGID1b::2xmTQ2-GID1b, isang 3.9 kb na fragment sa itaas ng rehiyon ng coding ng GID1b at isang 4.7 kb na fragment na naglalaman ng GID1b cDNA (1.3 kb) at terminator (3.4 kb) ang unang pinalaki gamit ang mga primer sa Supplementary Table 3 at pagkatapos ay ipinasok sa pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) at pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ayon sa pagkakabanggit, at sa huli ay muling pinagsama sa pDONR221 2xmTQ268 papunta sa pGreen 012567 target vector gamit ang Gateway cloning. Upang makabuo ng pCUC2::LSSmOrange, ang CUC2 promoter sequence (3229 bp upstream ng ATG) na sinundan ng coding sequence ng malalaking Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 na may N7 nuclear localization signal at NOS transcriptional terminator ay pinagsama-sama sa pGreen kanamycin targeting vector gamit ang Gateway 3-fragment recombination system (Invitrogen). Ang plant binary vector ay ipinakilala sa Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 at ipinakilala sa mga dahon ng Nicotiana benthamiana sa pamamagitan ng Agrobacterium infiltration method at sa Arabidopsis thaliana Col-0 sa pamamagitan ng floral dip method, ayon sa pagkakabanggit. Ang pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry at pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ay inihiwalay mula sa mga F3 at F1 progenies ng kani-kanilang mga crosses, ayon sa pagkakabanggit.
Isinagawa ang RNA in situ hybridization sa mga dulo ng usbong na may humigit-kumulang 1 cm ang haba72, na kinolekta at agad na inayos sa solusyon ng FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) na paunang pinalamig sa 4 °C. Pagkatapos ng 2 × 15 minutong vacuum treatment, pinalitan ang fixative at ang mga sample ay in-incubate magdamag. Ang mga GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, at RGL3 cDNA at mga antisense probe sa kanilang 3′-UTR ay na-synthesize gamit ang mga primer na ipinapakita sa Supplementary Table 3 gaya ng inilarawan nina Rosier et al.73. Ang mga probe na may label na Digoxigenin ay immunodetected gamit ang mga digoxigenin antibodies (3000-fold dilution; Roche, numero ng katalogo: 11 093 274 910), at ang mga seksyon ay kinulayan ng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fold dilution)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200-fold dilution) na solusyon.
Oras ng pag-post: Pebrero 10, 2025