Sa pag-aaral na ito, ang mga epektong pampasigla ng pinagsamang paggamot ngmga regulator ng paglago ng halaman(2,4-D at kinetin) at iron oxide nanoparticles (Fe₃O₄-NPs) sa in vitro morphogenesis at secondary metabolite production sa *Hypericum perforatum* L. Sinuri ang mga ito. Ang na-optimize na paggamot [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] ay makabuluhang nagpabuti sa mga parameter ng paglaki ng halaman: ang taas ng halaman ay tumaas ng 59.6%, ang haba ng ugat ay 114.0%, ang bilang ng usbong ay 180.0%, at ang sariwang bigat ng kalyo ay 198.3% kumpara sa control group. Pinahusay din ng pinagsamang paggamot na ito ang kahusayan sa regenerasyon (50.85%) at ang nilalaman ng hypericin ay 66.6%. Ang pagsusuri ng GC-MS ay nagpakita ng mataas na nilalaman ng hyperoside, β-patholene, at cetyl alcohol, na bumubuo sa 93.36% ng kabuuang peak area, habang ang nilalaman ng kabuuang phenolics at flavonoids ay tumaas ng hanggang 80.1%. Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang mga plant growth regulators (PGRs) at Fe₃O₄ nanoparticles (Fe₃O₄-NPs) ay may synergistic effect sa pamamagitan ng pagpapasigla ng organogenesis at akumulasyon ng mga bioactive compound, na kumakatawan sa isang promising na estratehiya para sa biotechnological na pagpapabuti ng mga halamang gamot.
Ang St. John's wort (Hypericum perforatum L.), na kilala rin bilang St. John's wort, ay isang perennial herbaceous plant ng pamilyang Hypericaceae na may halagang pang-ekonomiya.[1] Kabilang sa mga potensyal na bioactive component nito ang mga natural na tannin, xanthones, phloroglucinol, naphthalenedianthrone (hyperin at pseudohyperin), flavonoids, phenolic acids, at essential oils.[2,3,4] Maaaring paramihin ang St. John's wort sa pamamagitan ng mga tradisyonal na pamamaraan; gayunpaman, ang seasonality ng mga tradisyonal na pamamaraan, mababang pagtubo ng buto, at pagiging madaling kapitan ng sakit ay naglilimita sa potensyal nito para sa malawakang paglilinang at patuloy na pagbuo ng mga secondary metabolite.[1,5,6]
Kaya naman, ang in vitro tissue culture ay itinuturing na isang epektibong paraan para sa mabilis na pagpaparami ng halaman, konserbasyon ng mga mapagkukunan ng germplasm, at pagtaas ng ani ng mga nakapagpapagaling na compound [7, 8]. Ang mga plant growth regulator (PGR) ay gumaganap ng mahalagang papel sa pag-regulate ng morphogenesis at kinakailangan para sa in vitro na paglilinang ng callus at buong organismo. Ang pag-optimize ng kanilang mga konsentrasyon at kumbinasyon ay mahalaga para sa matagumpay na pagkumpleto ng mga prosesong ito sa pag-unlad [9]. Samakatuwid, ang pag-unawa sa naaangkop na komposisyon at konsentrasyon ng mga regulator ay mahalaga para sa pagpapabuti ng paglago at kapasidad sa pagbabagong-buhay ng St. John's wort (H. perforatum) [10].
Ang mga iron oxide nanoparticle (Fe₃O₄) ay isang klase ng mga nanoparticle na ginawa o ginagawa pa para sa tissue culture. Ang Fe₃O₄ ay may makabuluhang magnetic properties, mahusay na biocompatibility, at kakayahang itaguyod ang paglaki ng halaman at bawasan ang stress sa kapaligiran, kaya naman nakaakit ito ng malaking atensyon sa mga disenyo ng tissue culture. Ang mga potensyal na aplikasyon ng mga nanoparticle na ito ay maaaring kabilang ang pag-optimize ng in vitro culture upang itaguyod ang paghahati ng cell, mapabuti ang pagsipsip ng sustansya, at i-activate ang mga antioxidant enzyme [11].
Bagama't nagpakita ang mga nanoparticle ng magagandang epekto sa paglaki ng halaman, ang mga pag-aaral sa pinagsamang aplikasyon ng mga nanoparticle ng Fe₃O₄ at mga na-optimize na regulator ng paglago ng halaman sa *H. perforatum* ay nananatiling kakaunti. Upang punan ang kakulangan sa kaalamang ito, sinuri ng pag-aaral na ito ang mga epekto ng kanilang pinagsamang epekto sa in vitro morphogenesis at produksyon ng pangalawang metabolite upang magbigay ng mga bagong pananaw para sa pagpapabuti ng mga katangian ng mga halamang gamot. Samakatuwid, ang pag-aaral na ito ay may dalawang layunin: (1) i-optimize ang konsentrasyon ng mga regulator ng paglago ng halaman upang epektibong isulong ang pagbuo ng callus, pagbabagong-buhay ng usbong, at pag-uugat in vitro; at (2) suriin ang mga epekto ng mga nanoparticle ng Fe₃O₄ sa mga parameter ng paglago in vitro. Kasama sa mga plano sa hinaharap ang pagsusuri sa rate ng kaligtasan ng mga na-regenerate na halaman sa panahon ng acclimatization (in vitro). Inaasahan na ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay makabuluhang magpapabuti sa kahusayan ng micropropagation ng *H. perforatum*, sa gayon ay nakakatulong sa napapanatiling paggamit at mga aplikasyon ng biotechnological ng mahalagang halamang gamot na ito.
Sa pag-aaral na ito, nakakuha kami ng mga explant ng dahon mula sa mga halamang St. John's wort na itinanim sa bukid (mga halamang ina). Ginamit ang mga explant na ito upang ma-optimize ang mga kondisyon ng in vitro culture. Bago ikultura, ang mga dahon ay lubusang hinugasan sa ilalim ng umaagos na distilled water sa loob ng ilang minuto. Ang mga ibabaw ng explant ay dinidisimpekta sa pamamagitan ng paglulubog sa 70% ethanol sa loob ng 30 segundo, na sinundan ng paglulubog sa 1.5% sodium hypochlorite (NaOCl) na solusyon na naglalaman ng ilang patak ng Tween 20 sa loob ng 10 minuto. Panghuli, ang mga explant ay hinugasan ng tatlong beses gamit ang sterile distilled water bago ilipat sa susunod na culture medium.
Sa sumunod na apat na linggo, sinukat ang mga parametro ng pagbabagong-buhay ng usbong, kabilang ang bilis ng pagbabagong-buhay, bilang ng usbong bawat explant, at haba ng usbong. Kapag ang mga muling tumubong usbong ay umabot sa haba na hindi bababa sa 2 cm, inilipat ang mga ito sa isang rooting medium na binubuo ng half-strength MS medium, 0.5 mg/L indolebutyric acid (IBA), at 0.3% guar gum. Nagpatuloy ang rooting culture sa loob ng tatlong linggo, kung saan sinukat ang bilis ng pag-uugat, bilang ng ugat, at haba ng ugat. Ang bawat paggamot ay inulit nang tatlong beses, na may 10 explant na kinultura bawat replika, na nagbunga ng humigit-kumulang 30 explant bawat paggamot.
Ang taas ng halaman ay sinukat sa sentimetro (cm) gamit ang isang ruler, mula sa base ng halaman hanggang sa dulo ng pinakamataas na dahon. Ang haba ng ugat ay sinukat sa milimetro (mm) kaagad pagkatapos maingat na alisin ang mga punla at alisin ang medium ng pagtatanim. Ang bilang ng mga usbong bawat explant ay direktang binilang sa bawat halaman. Ang bilang ng mga itim na batik sa mga dahon, na kilala bilang mga nodule, ay sinukat nang biswal. Ang mga itim na nodule na ito ay pinaniniwalaang mga glandula na naglalaman ng hypericin, o mga oxidative spot, at ginagamit bilang isang pisyolohikal na tagapagpahiwatig ng tugon ng halaman sa paggamot. Pagkatapos alisin ang lahat ng medium ng pagtatanim, ang sariwang bigat ng mga punla ay sinukat gamit ang isang elektronikong iskala na may katumpakan na milligrams (mg).
Ang paraan ng pagkalkula ng bilis ng pagbuo ng kalyo ay ang mga sumusunod: pagkatapos itanim ang mga explant sa isang medium na naglalaman ng iba't ibang growth regulator (kinase, 2,4-D, at Fe3O4) sa loob ng apat na linggo, binibilang ang bilang ng mga explant na may kakayahang bumuo ng kalyo. Ang pormula para sa pagkalkula ng bilis ng pagbuo ng kalyo ay ang mga sumusunod:
Ang bawat paggamot ay inulit nang tatlong beses, na may hindi bababa sa 10 explant na sinuri sa bawat pag-uulit.
Ang antas ng pagbabagong-buhay ay sumasalamin sa proporsyon ng tisyu ng kalyo na matagumpay na nakakumpleto sa proseso ng pagkakaiba-iba ng usbong pagkatapos ng yugto ng pagbuo ng kalyo. Ipinapakita ng tagapagpahiwatig na ito ang kakayahan ng tisyu ng kalyo na magbago tungo sa naiibang tisyu at lumaki tungo sa mga bagong organo ng halaman.
Ang koepisyent ng pag-uugat ay ang proporsyon ng bilang ng mga sanga na may kakayahang mag-ugat sa kabuuang bilang ng mga sanga. Ang tagapagpahiwatig na ito ay sumasalamin sa tagumpay ng yugto ng pag-uugat, na mahalaga sa micropropagation at pagpaparami ng halaman, dahil ang mahusay na pag-uugat ay nakakatulong sa mga punla na mas mabuhay sa mga kondisyon ng paglaki.
Ang mga compound ng hypericin ay kinuha gamit ang 90% methanol. Limampung mg ng pinatuyong materyal ng halaman ang idinagdag sa 1 ml ng methanol at na-sonicate sa loob ng 20 minuto sa 30 kHz sa isang ultrasonic cleaner (modelo A5120-3YJ) sa temperatura ng silid sa dilim. Pagkatapos ng sonication, ang sample ay sinentrifuga sa 6000 rpm sa loob ng 15 minuto. Ang supernatant ay kinolekta, at ang absorbance ng hypericin ay sinukat sa 592 nm gamit ang Plus-3000 S spectrophotometer ayon sa pamamaraang inilarawan ni Conceiçao et al. [14].
Karamihan sa mga paggamot gamit ang mga plant growth regulator (PGR) at iron oxide nanoparticles (Fe₃O₄-NPs) ay hindi nagdulot ng pagbuo ng itim na nodule sa mga muling nabuo na dahon ng usbong. Walang naobserbahang nodule sa alinman sa mga paggamot na may 0.5 o 1 mg/L 2,4-D, 0.5 o 1 mg/L kinetin, o 1, 2, o 4 mg/L iron oxide nanoparticles. Ilang kombinasyon ang nagpakita ng bahagyang pagtaas sa pag-unlad ng nodule (ngunit hindi makabuluhan sa istatistika) sa mas mataas na konsentrasyon ng kinetin at/o iron oxide nanoparticles, tulad ng kumbinasyon ng 2,4-D (0.5–2 mg/L) na may kinetin (1–1.5 mg/L) at iron oxide nanoparticles (2–4 mg/L). Ang mga resultang ito ay ipinapakita sa Figure 2. Ang mga itim na nodule ay kumakatawan sa mga glandulang mayaman sa hypericin, parehong natural na nagaganap at kapaki-pakinabang. Sa pag-aaral na ito, ang mga itim na nodule ay pangunahing nauugnay sa pag-itim ng mga tisyu, na nagpapahiwatig ng isang kanais-nais na kapaligiran para sa akumulasyon ng hypericin. Ang paggamot gamit ang 2,4-D, kinetin, at Fe₃O₄ nanoparticles ay nagtaguyod ng paglaki ng callus, nabawasan ang pag-itim, at nadagdagan ang nilalaman ng chlorophyll, na nagmumungkahi ng pinabuting metabolic function at potensyal na pagbawas ng oxidative damage [37]. Sinuri ng pag-aaral na ito ang mga epekto ng kinetin kasama ng 2,4-D at Fe₃O₄ nanoparticles sa paglaki at pag-unlad ng St. John's wort callus (Fig. 3a–g). Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang Fe₃O₄ nanoparticles ay may mga antifungal at antimicrobial na aktibidad [38, 39] at, kapag ginamit kasama ng mga plant growth regulator, maaaring pasiglahin ang mga mekanismo ng depensa ng halaman at bawasan ang mga cellular stress indices [18]. Bagama't ang biosynthesis ng mga secondary metabolite ay genetically regulated, ang kanilang aktwal na ani ay lubos na nakadepende sa mga kondisyon ng kapaligiran. Ang mga pagbabago sa metabolic at morphological ay maaaring makaimpluwensya sa mga antas ng secondary metabolite sa pamamagitan ng pag-regulate sa ekspresyon ng mga partikular na gene ng halaman at pagtugon sa mga salik sa kapaligiran. Bukod pa rito, ang mga inducer ay maaaring mag-trigger ng pag-activate ng mga bagong gene, na siya namang nagpapasigla sa aktibidad ng enzymatic, na sa huli ay nagpapa-activate ng maraming biosynthetic pathway at humahantong sa pagbuo ng mga secondary metabolite. Bukod pa rito, ipinakita ng isa pang pag-aaral na ang pagbabawas ng shading ay nagpapataas ng pagkakalantad sa sikat ng araw, sa gayon ay nagpapataas ng temperatura sa araw sa natural na tirahan ng *Hypericum perforatum*, na nakakatulong din sa pagtaas ng ani ng hypericin. Batay sa mga datos na ito, sinisiyasat ng pag-aaral na ito ang papel ng mga iron nanoparticle bilang mga potensyal na inducer sa tissue culture. Ipinakita ng mga resulta na ang mga nanoparticle na ito ay maaaring mag-activate ng mga gene na kasangkot sa hesperidin biosynthesis sa pamamagitan ng enzymatic stimulation, na humahantong sa pagtaas ng akumulasyon ng compound na ito (Fig. 2). Samakatuwid, kumpara sa mga halaman na lumalaki sa ilalim ng natural na mga kondisyon, maaaring maitalo na ang produksyon ng mga naturang compound in vivo ay maaari ring mapahusay kapag ang katamtamang stress ay pinagsama sa pag-activate ng mga gene na kasangkot sa biosynthesis ng mga secondary metabolite. Ang mga kombinasyong paggamot sa pangkalahatan ay may positibong epekto sa rate ng regeneration, ngunit sa ilang mga kaso, ang epektong ito ay humihina. Kapansin-pansin, ang paggamot gamit ang 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinase, at iba't ibang konsentrasyon ay maaaring nakapag-iisa at makabuluhang magpataas ng rate ng regeneration ng 50.85% kumpara sa control group (Fig. 4c). Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang mga partikular na kumbinasyon ng mga nanohormone ay maaaring kumilos nang synergistically upang itaguyod ang paglaki ng halaman at produksyon ng metabolite, na may malaking kahalagahan para sa tissue culture ng mga halamang gamot. Ipinakita nina Palmer at Keller [50] na ang paggamot ng 2,4-D ay maaaring nakapag-iisa na mag-udyok sa pagbuo ng callus sa St. perforatum, habang ang pagdaragdag ng kinase ay makabuluhang nagpahusay sa pagbuo at regeneration ng callus. Ang epektong ito ay dahil sa pagpapabuti ng hormonal balance at pagpapasigla ng cell division. Natuklasan nina Bal et al. [51] na ang paggamot ng Fe₃O₄-NP ay maaaring nakapag-iisa na mapahusay ang function ng mga antioxidant enzyme, sa gayon ay nagtataguyod ng paglaki ng ugat sa St. perforatum. Ang mga culture media na naglalaman ng Fe₃O₄ nanoparticles sa konsentrasyon na 0.5 mg/L, 1 mg/L, at 1.5 mg/L ay nagpabuti sa regeneration rate ng mga halamang flax [52]. Ang paggamit ng kinetin, 2,4-dichlorobenzothiazolinone, at Fe₃O₄ nanoparticles ay makabuluhang nagpabuti sa callus at root formation rates, gayunpaman, ang mga potensyal na side effect ng paggamit ng mga hormone na ito para sa in vitro regeneration ay kailangang isaalang-alang. Halimbawa, ang pangmatagalan o mataas na konsentrasyon ng paggamit ng 2,4-dichlorobenzothiazolinone o kinetin ay maaaring magresulta sa somatic clonal variation, oxidative stress, abnormal callus morphology, o vitrification. Samakatuwid, ang mataas na regeneration rate ay hindi kinakailangang hulaan ang genetic stability. Ang lahat ng regenerated na halaman ay dapat tasahin gamit ang mga molecular marker (hal. RAPD, ISSR, AFLP) o cytogenetic analysis upang matukoy ang kanilang homogeneity at pagkakatulad sa mga halamang in vivo [53,54,55].
Sa unang pagkakataon, ipinakita ng pag-aaral na ito na ang pinagsamang paggamit ng mga plant growth regulator (2,4-D at kinetin) kasama ang mga Fe₃O₄ nanoparticle ay maaaring mapahusay ang morphogenesis at ang akumulasyon ng mga pangunahing bioactive metabolite (kabilang ang hypericin at hyperoside) sa *Hypericum perforatum*. Ang na-optimize na regimen sa paggamot (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) ay hindi lamang nagpahusay sa pagbuo ng callus, organogenesis, at ani ng pangalawang metabolite kundi nagpakita rin ng banayad na epekto, na posibleng nagpapabuti sa stress tolerance at medicinal value ng halaman. Ang kombinasyon ng nanotechnology at plant tissue culture ay nagbibigay ng napapanatiling at mahusay na plataporma para sa malawakang in vitro na produksyon ng mga medicinal compound. Ang mga resultang ito ay nagbubukas ng daan para sa mga pang-industriya na aplikasyon at pananaliksik sa hinaharap sa mga mekanismo ng molekula, pag-optimize ng dosis at genetic precision, sa gayon ay iniuugnay ang pangunahing pananaliksik sa mga halamang gamot sa praktikal na biotechnology.
Oras ng pag-post: Disyembre 12, 2025