Ang anthelmintic na gamot na N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ay naiulat na pumipigil sa AChE (acetylcholinesterase) at may potensyal na carcinogenic properties dahil sa labis na vascularization. Sa papel na ito, ipinapakita namin na ang DEET ay partikular na pinasisigla ang mga endothelial cells na nagsusulong ng angiogenesis, sa gayon ay nagdaragdag ng paglaki ng tumor. Ina-activate ng DEET ang mga proseso ng cellular na humahantong sa angiogenesis, kabilang ang paglaganap, paglipat, at pagdirikit. Ito ay nauugnay sa pagtaas ng NO production at VEGF expression sa mga endothelial cells. Ang pagpapatahimik ng M3 o paggamit ng mga pharmacological M3 inhibitor ay tinanggal ang lahat ng mga epektong ito, na nagmumungkahi na angiogenesis na dulot ng DEET ay sensitibo sa M3. Ang mga eksperimento na kinasasangkutan ng calcium signaling sa mga endothelial at HEK na mga cell na nag-overexpress ng mga M3 receptor, pati na rin ang mga pag-aaral na nagbubuklod at docking, ay nagpapahiwatig na ang DEET ay gumaganap bilang isang allosteric modulator ng mga M3 receptor. Higit pa rito, pinipigilan ng DEET ang AChE, sa gayon ay pinapataas ang bioavailability ng acetylcholine at ang pagbubuklod nito sa mga M3 receptor, at pagpapahusay ng mga proangiogenic na epekto sa pamamagitan ng allosteric regulation.
Ang mga pangunahing EC ay nakahiwalay sa aorta ng mga Swiss na daga. Ang paraan ng pagkuha ay inangkop mula sa Kobayashi protocol 26 . Ang mga Murine EC ay nilinang sa EBM-2 medium na dinagdagan ng 5% na heat-inactivated na FBS hanggang sa ikaapat na sipi.
Ang epekto ng dalawang konsentrasyon ng DEET sa paglaganap ng HUVEC, U87MG, o BF16F10 ay nasuri gamit ang CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sa madaling sabi, 5.103 na mga cell bawat balon ay na-seed sa isang 96-well plate, pinahihintulutang mag-attach sa magdamag, at pagkatapos ay ginagamot sa DEET sa loob ng 24 na oras. Pagkatapos alisin ang growth medium, magdagdag ng dye binding solution sa bawat balon ng microplate at i-incubate ang mga cell sa 37 °C sa loob ng 30 min. Natukoy ang mga antas ng fluorescence gamit ang isang Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) na nilagyan ng 485 nm excitation filter at 530 nm emission filter.
Ang HUVEC ay na-seed sa 96-well plate na may density na 104 na mga cell bawat balon. Ang mga cell ay ginagamot sa DEET sa loob ng 24 na oras. Ang cell viability ay nasuri gamit ang isang colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655). Ang mga halaga ng optical density ay nakuha sa isang multimode microplate reader (Mithras LB940) sa isang wavelength na 570 nm.
Ang mga epekto ng DEET ay pinag-aralan gamit ang in vitro angiogenesis assays. Ang paggamot na may 10-8 M o 10-5 M DEET ay nagpapataas ng pagbuo ng haba ng capillary sa HUVECs (Larawan 1a, b, puting bar). Kung ikukumpara sa control group, ang paggamot na may mga konsentrasyon ng DEET mula 10-14 hanggang 10-5 M ay nagpakita na ang haba ng capillary ay umabot sa isang talampas sa 10-8 M DEET (Karagdagang Fig. S2). Walang nakitang makabuluhang pagkakaiba sa in vitro proangiogenic na epekto ng HUVEC na ginagamot sa DEET sa hanay ng konsentrasyon na 10-8 M at 10-5 M.
Upang matukoy ang epekto ng DEET sa neovascularization, nagsagawa kami ng mga pag-aaral sa vivo neovascularization. Pagkatapos ng 14 na araw, ang mga daga na na-injected ng mga endothelial cells na precultured na may 10-8 M o 10-5 M DEET ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa nilalaman ng hemoglobin (Larawan 1c, mga puting bar).
Higit pa rito, ang DEET-induced neovascularization ay pinag-aralan sa U87MG xenograft-bearing mice na na-injected araw-araw (ip) kasama ang DEET sa isang dosis na kilala upang mag-udyok ng mga konsentrasyon ng plasma na 10-5 M, na normal sa mga nakalantad na tao. sa 23. Ang mga natukoy na tumor (ibig sabihin, mga tumor >100 mm3) ay naobserbahan 14 na araw pagkatapos ng pag-iniksyon ng mga U87MG na selula sa mga daga. Sa araw na 28, ang paglaki ng tumor ay makabuluhang pinahusay sa mga daga na ginagamot ng DEET kumpara sa mga control mice (Larawan 1d, mga parisukat). Bukod dito, ang paglamlam ng CD31 ng mga bukol ay nagpakita na ang DEET ay makabuluhang nadagdagan ang capillary area ngunit hindi microvessel density. (Larawan 1e–g).
Upang matukoy ang papel ng mga muscarinic receptor sa DETA-induced proliferation, ginamit ang 10-8 M o 10-5 M DETA sa pagkakaroon ng pFHHSiD (10-7 M, isang selective M3 receptor antagonist). Paggamot ng HUVEC. Ang pFHHSiD ay ganap na hinarangan ang mga proliferative na katangian ng DETA sa lahat ng mga konsentrasyon (Talahanayan 1).
Sa ilalim ng mga kundisyong ito, sinuri din namin kung tataas ng DEET ang haba ng capillary sa mga HUVEC cells. Katulad nito, makabuluhang napigilan ng pFHHSiD ang haba ng capillary na dulot ng DEET (Fig. 1a, b, mga gray na bar). Bukod dito, ang mga katulad na eksperimento ay isinagawa kasama ang M3 siRNA. Bagaman hindi epektibo ang control siRNA sa pagsulong ng pagbuo ng capillary, ang pag-silencing ng M3 muscarinic receptor ay tinanggal ang kakayahan ng DEET na dagdagan ang haba ng capillary (Larawan 1a, b, mga itim na bar).
Higit pa rito, ang parehong 10-8 M o 10-5 M DEET-induced vascularization sa vitro at neovascularization sa vivo ay ganap na hinarangan ng pFHHSiD (Fig. 1c, d, circles). Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang DEET ay nagtataguyod ng angiogenesis sa pamamagitan ng isang pathway na sensitibo sa mga piling M3 receptor antagonist o M3 siRNA.
Ang AChE ay ang molekular na target ng DEET. Ang mga gamot tulad ng donepezil, na kumikilos bilang AChE inhibitors, ay maaaring pasiglahin ang EC angiogenesis sa vitro at sa mouse hindlimb ischemia na mga modelo14. Sinubukan namin ang epekto ng dalawang konsentrasyon ng DEET sa aktibidad ng AChE enzyme sa HUVEC. Ang mababang (10-8 M) at mataas (10-5 M) na konsentrasyon ng DEET ay bumaba sa endothelial AChE na aktibidad kumpara sa mga kondisyon ng kontrol (Fig. 2).
Ang parehong konsentrasyon ng DEET (10-8 M at 10-5 M) ay nagbawas ng aktibidad ng acetylcholinesterase sa HUVEC. Ang BW284c51 (10-5 M) ay ginamit bilang isang kontrol para sa mga inhibitor ng acetylcholinesterase. Ang mga resulta ay ipinahayag bilang porsyento ng aktibidad ng AChE sa HUVEC na ginagamot sa dalawang konsentrasyon ng DEET kumpara sa mga cell na ginagamot sa sasakyan. Ang mga halaga ay ipinahayag bilang mean ± SEM ng anim na independiyenteng mga eksperimento. *p <0.05 kumpara sa kontrol (Kruskal-Wallis at Dunn maramihang paghahambing na pagsubok).
Ang Nitric oxide (NO) ay kasangkot sa proseso ng angiogenic 33, samakatuwid, WALANG produksyon sa DEET-stimulated HUVECs ang pinag-aralan. Ang produksyon ng endothelial NO na ginagamot ng DEET ay nadagdagan kumpara sa mga control cell, ngunit naabot lamang ang kahalagahan sa isang dosis na 10-8 M (Fig. 3c). Upang matukoy ang mga pagbabago sa molekular na kumokontrol sa DEET-induced NO production, ang eNOS expression at activation ay sinuri ng Western blotting. Bagaman hindi binago ng paggamot ng DEET ang ekspresyon ng eNOS, makabuluhang nadagdagan nito ang eNOS phosphorylation sa activating site nito (Ser-1177) habang binabawasan ang inhibitory site nito (Thr-495) kumpara sa mga hindi ginagamot na cell sa eNOS phosphorylation (Fig. 3d). Bukod dito, ang ratio ng phosphorylated eNOS sa activation site at inhibitory site ay kinakalkula pagkatapos na gawing normal ang halaga ng phosphorylated eNOS sa kabuuang halaga ng enzyme. Ang ratio na ito ay makabuluhang nadagdagan sa mga HUVEC na ginagamot sa bawat konsentrasyon ng DEET kumpara sa mga hindi ginagamot na mga cell (Larawan 3d).
Sa wakas, ang pagpapahayag ng VEGF, isa sa mga pangunahing proangiogenic na kadahilanan, ay nasuri ng Western blotting. Ang DEET ay makabuluhang nadagdagan ang expression ng VEGF, samantalang ang pFHHSiD ay ganap na hinarangan ang expression na ito.
Dahil ang mga epekto ng DEET ay sensitibo sa parehong pharmacological blockade at downregulation ng M3 receptors, sinubukan namin ang hypothesis na maaaring mapahusay ng DEET ang calcium signaling. Nakakagulat, nabigo ang DEET na mapataas ang cytoplasmic calcium sa HUVEC (hindi ipinakita ang data) at HEK/M3 (Fig. 4a, b) para sa parehong mga konsentrasyon na ginamit.
Oras ng post: Dis-30-2024