Ang gamot na anthelmintiko na N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ay naiulat na pumipigil sa AChE (acetylcholinesterase) at may mga potensyal na carcinogenic properties dahil sa labis na vascularization. Sa papel na ito, ipinapakita namin na ang DEET ay partikular na nagpapasigla sa mga endothelial cell na nagtataguyod ng angiogenesis, sa gayon ay pinapataas ang paglaki ng tumor. Pinapagana ng DEET ang mga proseso ng cellular na humahantong sa angiogenesis, kabilang ang paglaganap, paglipat, at pagdikit. Ito ay nauugnay sa pagtaas ng produksyon ng NO at ekspresyon ng VEGF sa mga endothelial cell. Ang pagpapatahimik ng M3 o paggamit ng mga pharmacological M3 inhibitor ay nag-aalis ng lahat ng mga epektong ito, na nagmumungkahi na ang DEET-induced angiogenesis ay sensitibo sa M3. Ang mga eksperimento na kinasasangkutan ng calcium signaling sa mga endothelial at HEK cell na labis na nagpapahayag ng mga M3 receptor, pati na rin ang mga pag-aaral sa pagbubuklod at pag-dock, ay nagpapahiwatig na ang DEET ay gumaganap bilang isang allosteric modulator ng mga M3 receptor. Bukod dito, pinipigilan ng DEET ang AChE, sa gayon ay pinapataas ang bioavailability ng acetylcholine at ang pagbubuklod nito sa mga M3 receptor, at pinahuhusay ang mga proangiogenic effect sa pamamagitan ng allosteric regulation.
Ang mga primary EC ay inihiwalay mula sa aorta ng mga Swiss mice. Ang paraan ng pagkuha ay hinango mula sa Kobayashi protocol 26. Ang mga Murine EC ay kinultura sa EBM-2 medium na may 5% heat-inactivated FBS hanggang sa ikaapat na passage.
Ang epekto ng dalawang konsentrasyon ng DEET sa pagdami ng HUVEC, U87MG, o BF16F10 ay sinuri gamit ang CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sa madaling salita, 5.103 na selula bawat well ang itinanim sa isang 96-well plate, hinayaan itong kumapit magdamag, at pagkatapos ay ginamot gamit ang DEET sa loob ng 24 na oras. Pagkatapos tanggalin ang growth medium, idagdag ang dye binding solution sa bawat well ng microplate at i-incubate ang mga selula sa 37 °C sa loob ng 30 minuto. Ang mga antas ng fluorescence ay natukoy gamit ang isang Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) na nilagyan ng 485 nm excitation filters at 530 nm emission filters.
Ang mga HUVEC ay inilagay sa 96-well plates sa density na 104 cells kada well. Ang mga cells ay ginamot gamit ang DEET sa loob ng 24 oras. Ang cell viability ay tinasa gamit ang colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655). Ang mga optical density values ay nakuha sa isang multimode microplate reader (Mithras LB940) sa wavelength na 570 nm.
Ang mga epekto ng DEET ay pinag-aralan gamit ang in vitro angiogenesis assays. Ang paggamot gamit ang 10-8 M o 10-5 M DEET ay nagpataas sa pagbuo ng capillary length sa mga HUVEC (Fig. 1a, b, puting bar). Kung ikukumpara sa control group, ang paggamot gamit ang mga konsentrasyon ng DEET mula 10-14 hanggang 10-5 M ay nagpakita na ang capillary length ay umabot sa isang plateau sa 10-8 M DEET (Supplementary Fig. S2). Walang natagpuang makabuluhang pagkakaiba sa in vitro proangiogenic effect ng mga HUVEC na ginagamot gamit ang DEET sa hanay ng konsentrasyon na 10-8 M at 10-5 M.
Upang matukoy ang epekto ng DEET sa neovascularization, nagsagawa kami ng mga in vivo neovascularization studies. Pagkatapos ng 14 na araw, ang mga daga na tinurukan ng mga endothelial cell na precultured ng 10-8 M o 10-5 M DEET ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa nilalaman ng hemoglobin (Fig. 1c, mga puting bar).
Bukod pa rito, pinag-aralan ang neovascularization na dulot ng DEET sa mga daga na may U87MG xenograft na tinurukan araw-araw (ip) ng DEET sa dosis na kilalang nagdudulot ng konsentrasyon sa plasma na 10-5 M, na normal sa mga taong nalantad. sa 23. Ang mga natutukoy na tumor (ibig sabihin, mga tumor na >100 mm3) ay naobserbahan 14 na araw pagkatapos ng pag-iniksyon ng mga selula ng U87MG sa mga daga. Sa ika-28 araw, ang paglaki ng tumor ay makabuluhang pinahusay sa mga daga na ginamot ng DEET kumpara sa mga control mice (Fig. 1d, squares). Bukod pa rito, ipinakita ng paglamlam ng CD31 ng mga tumor na ang DEET ay makabuluhang nagpataas ng capillary area ngunit hindi ng microvessel density. (Fig. 1e–g).
Upang matukoy ang papel ng mga muscarinic receptor sa paglaganap na dulot ng DETA, ginamit ang 10-8 M o 10-5 M DETA sa presensya ng pFHHSiD (10-7 M, isang pumipiling M3 receptor antagonist). Paggamot gamit ang HUVEC. Ganap na hinarangan ng pFHHSiD ang mga katangiang proliferative ng DETA sa lahat ng konsentrasyon (Talahanayan 1).
Sa ilalim ng mga kundisyong ito, sinuri rin namin kung ang DEET ay magpapataas ng haba ng capillary sa mga selula ng HUVEC. Katulad nito, ang pFHHSiD ay makabuluhang pumigil sa haba ng capillary na dulot ng DEET (Fig. 1a, b, gray bars). Bukod pa rito, ang mga katulad na eksperimento ay isinagawa gamit ang M3 siRNA. Bagama't ang control siRNA ay hindi epektibo sa pagtataguyod ng pagbuo ng capillary, ang pagpapatahimik ng M3 muscarinic receptor ay nagpawalang-bisa sa kakayahan ng DEET na pataasin ang haba ng capillary (Fig. 1a, b, black bars).
Bukod pa rito, ang parehong 10-8 M o 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro at neovascularization in vivo ay ganap na naharang ng pFHHSiD (Fig. 1c, d, circles). Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na itinataguyod ng DEET ang angiogenesis sa pamamagitan ng isang pathway na sensitibo sa mga selective M3 receptor antagonist o M3 siRNA.
Ang AChE ang molekular na target ng DEET. Ang mga gamot tulad ng donepezil, na kumikilos bilang mga AChE inhibitor, ay maaaring magpasigla ng EC angiogenesis in vitro at sa mga modelo ng ischemia ng hindlimb ng daga14. Sinubukan namin ang epekto ng dalawang konsentrasyon ng DEET sa aktibidad ng enzyme ng AChE sa HUVEC. Ang mababa (10-8 M) at mataas (10-5 M) na konsentrasyon ng DEET ay nagpababa ng aktibidad ng endothelial AChE kumpara sa mga kondisyon ng kontrol (Fig. 2).
Ang parehong konsentrasyon ng DEET (10-8 M at 10-5 M) ay nagpababa sa aktibidad ng acetylcholinesterase sa HUVEC. Ang BW284c51 (10-5 M) ay ginamit bilang kontrol para sa mga acetylcholinesterase inhibitor. Ang mga resulta ay ipinapahayag bilang porsyento ng aktibidad ng AChE sa HUVEC na ginamot gamit ang dalawang konsentrasyon ng DEET kumpara sa mga selulang ginamot gamit ang sasakyan. Ang mga halaga ay ipinapahayag bilang mean ± SEM ng anim na independiyenteng eksperimento. *p < 0.05 kumpara sa kontrol (Kruskal-Wallis at Dunn multiple comparison test).
Ang nitric oxide (NO) ay sangkot sa angiogenic process 33, samakatuwid, pinag-aralan ang produksyon ng NO sa mga DEET-stimulated HUVEC. Ang produksyon ng endothelial NO na ginamot ng DEET ay tumaas kumpara sa mga control cell, ngunit umabot lamang sa significance sa dosis na 10-8 M (Fig. 3c). Upang matukoy ang mga pagbabago sa molekula na kumokontrol sa produksyon ng NO na dulot ng DEET, ang ekspresyon at pag-activate ng eNOS ay sinuri sa pamamagitan ng Western blotting. Bagama't hindi binago ng paggamot ng DEET ang ekspresyon ng eNOS, malaki ang nadagdag nitong phosphorylation ng eNOS sa activating site nito (Ser-1177) habang binabawasan ang inhibitory site nito (Thr-495) kumpara sa mga untreated cell sa eNOS phosphorylation (Fig. 3d). Bukod dito, ang ratio ng phosphorylated eNOS sa activation site at inhibitory site ay kinalkula matapos gawing normal ang dami ng phosphorylated eNOS sa kabuuang dami ng enzyme. Ang ratio na ito ay malaki ang nadagdag sa mga HUVEC na ginamot sa bawat konsentrasyon ng DEET kumpara sa mga untreated cell (Fig. 3d).
Panghuli, ang ekspresyon ng VEGF, isa sa mga pangunahing proangiogenic factor, ay sinuri sa pamamagitan ng Western blotting. Malaki ang naitutulong ng DEET sa ekspresyon ng VEGF, samantalang ang pFHHSiD ay ganap na humarang sa ekspresyong ito.
Dahil ang mga epekto ng DEET ay sensitibo sa parehong pharmacological blockade at downregulation ng M3 receptors, sinubukan namin ang hypothesis na maaaring mapahusay ng DEET ang calcium signaling. Nakakagulat na nabigo ang DEET na pataasin ang cytoplasmic calcium sa HUVEC (hindi ipinakita ang datos) at HEK/M3 (Fig. 4a, b) para sa parehong konsentrasyon na ginamit.
Oras ng pag-post: Disyembre 30, 2024