Ang mga pestisidyo ay may mahalagang papel sa pagtugon sa pandaigdigang kakulangan sa pagkain at paglaban sa mga sakit na dala ng tao. Gayunpaman, ang lumalaking problema ng resistensya sa pestisidyo ay agarang nangangailangan ng pagtuklas ng mga bagong compound na tumatarget sa mga target na hindi gaanong nagagamit. Ang mga channel ng insect transient receptor potential (TRPV)—Nanzhong (Nan) at inactive (Iav)—ay maaaring bumuo ng mga heterologous channel (Nan-Iav) at mai-localize sa mga mechanosensory organ na namamagitan sa geotropism, hearing, at proprioception sa mga insekto. Ang ilang mga pestisidyo, tulad ng aphidopyrrolidone (AP), ay tinatarget ang Nan-Iav sa pamamagitan ng mga hindi kilalang mekanismo. Ang AP ay epektibo laban sa mga insektong sumisipsip ng butas (hemipterans), na pumipigil sa pagkain sa pamamagitan ng paggambala sa paggana ng mga filament. Ang AP ay maaari lamang magbigkis sa Nan, ngunit ang Nan-Iav lamang ang maaaring makipag-ugnayan sa mga agonist, kabilang ang endogenous nicotinamide (NAM), sa gayon ay nagpapakita ng aktibidad ng channel. Sa kabila ng potensyal ng Nan-Iav bilang isang target na insecticide, kaunti lamang ang nalalaman tungkol sa channel assembly nito, mga regulatory binding site, at regulasyon na umaasa sa Ca2+, na humahadlang sa karagdagang pag-unlad ng insecticide. Sa pag-aaral na ito, ginamit ang cryo-electron microscopy upang matukoy ang istruktura ng Nan-Iav sa mga insektong Hemiptera sa estadong walang calmodulin-ligand, pati na rin sa AP at NAM sa hangganan ng ankyrin repeat cytoplasmic domain (ARD). Nakakagulat, natuklasan namin na ang protina ng Nan mismo ay maaaring bumuo ng isang pentamer, na pinatatag ng mga interaksyon ng ARD na pinamagitan ng AP. Ipinapakita ng pag-aaral na ito ang mga interaksyon ng molekula sa pagitan ng mga insecticide at agonist at Nan-Iav, na nagbibigay-diin sa kahalagahan ng ARD sa paggana at pag-assemble ng channel, at paggalugad sa mekanismo ng regulasyon ng Ca2+.
Sa gitna ng patuloy na tumitinding pandaigdigang pagbabago ng klima, ang lumalalang pandaigdigang seguridad sa pagkain ay isa sa mga pangunahing hamon ng ika-21 siglo, na may kasunod na mga kahihinatnan para sa lipunan.1,2Tinatantya ng ulat ng World Health Organization na State of Food Security and Nutrition in the World 2023 (SOFI) na humigit-kumulang 2.33 bilyong tao sa buong mundo ang dumaranas ng katamtaman hanggang sa matinding kawalan ng seguridad sa pagkain, isang matagal nang problema.3,4Sa kasamaang palad, tinatayang 20% hanggang 30% o higit pa ng ani ng pananim ang nawawala taun-taon dahil sa mga peste at pathogen, at inaasahang palalalahin ng global warming ang resistensya ng mga peste at kahinaan ng pananim.4,5,6,7,8Ang pagbuo ng pestisidyo ay mahalaga hindi lamang upang protektahan ang mga pananim mula sa mga peste at mabawasan ang pagkalat ng mga pathogen na dala ng vector, kundi pati na rin upang labanan ang mga sakit na dala ng vector sa tao tulad ng dengue fever, malaria, at Chagas disease, na lalong lumalaban sa mga pestisidyo.5,9,10,11
Kabilang sa mga pangunahing target ng mga neurotoxic insecticide, ang heterotetrameric TRPV channel na Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) ay kumakatawan sa isang klase ng mga target na insecticide na natuklasan lamang nitong nakaraang dekada, kabilang ang mga komersyal na makukuhang insecticide tulad ng imidacloprid at pyraclostrobin.12,13,14Ang semisynthetic insecticide na aphidopyrrolifen (AP) ay isang bagong binuo at komersyalisadong produkto na ang pangunahing sangkap ay ang aktibong insecticide na Inscalis®, na nagbibigkis sa AP sa antas ng aktibidad na subnanomolar.15Ang AP ay nagpapakita ng mababang talamak na toxicity sa mga pollinator, kapaki-pakinabang na insekto, at iba pang hindi target na organismo, at kapag ginamit ayon sa mga tagubilin sa etiketa, maaari nitong bawasan ang presyon ng resistensya sa ibang mga insecticide.16,17,18Ang Nan at Iav ay malawak na ipinamamahagi sa mga uri ng insekto, ay magkasamang ipinapahayag lamang sa mga chordal stretch receptor neuron ng antennae at mga paa't kamay, at mahalaga para sa pandinig, persepsyon ng grabidad, at proprioception.13,16,19,20,21,22Pinasisigla ng AP, imidacloprid, at pyraclostrobin ang Nan-Iav complex sa pamamagitan ng isang natatanging mekanismo, na sa huli ay pumipigil sa proprioceptive signal transduction.13,16,23Sa mga insektong sumisipsip (hemipteran) tulad ng mga aphid at whiteflies, ang pagkawala ng proprioception ay nagpapahina sa kanilang kakayahang kumain, na sa huli ay humahantong sa kamatayan.13,24Kapansin-pansin, ang AP ay nagpapakita ng mataas na affinity para sa Nan-Iav complex at mababang affinity para sa Nan lamang. Ang pagbigkis ng AP sa Nan-Iav ay nagdudulot ng electrical current, ngunit ang pagbigkis sa Nan lamang ay hindi nagpapasigla sa aktibidad ng channel. Ang Iav mismo ay hindi talaga nagbibigkis sa AP.16Ipinahihiwatig nito na ang Nan at Iav ay maaaring magbigkis upang bumuo ng iba't ibang Nan-Iav channel complexes (hal., na may iba't ibang stoichiometric ratios o iba't ibang kaayusan sa loob ng parehong stoichiometric ratio) o na ang AP ay maaaring magbigkis sa maraming lugar. Bukod pa rito, ang natural agonist nicotinamide (NAM) ay nagbibigkis sa Drosophila Nan-Iav na may micromolar affinity, na nagpapakita ng mga epekto na katulad ng sa mga aphids (AP) in vitro.16,25at pagpigil sa pagpaparami at pagpapakain ng mga aphid, na humahantong sa kanilang pagkamatay25,26Ang mga datos na ito ay nagbabangon ng maraming tanong. Halimbawa, nananatiling hindi malinaw kung paano nabubuo ang Nan-Iav heterodimer, kung aling mga binding site ang ginagamit upang baguhin ang maliliit na molekula, at kung paano kinokontrol ng maliliit na molekulang ito ang function ng channel sa pamamagitan ng pagsugpo sa proprioception. Bukod pa rito, ang mga dahilan kung bakit ang Nan mismo ay hindi aktibo at may mababang affinity para sa AP, habang ang Nan-Iav heterodimer ay aktibo at nagbibigkis sa AP nang may mas mataas na affinity, ay nananatiling hindi malinaw. Panghuli, kaunti pa ang nalalaman tungkol sa regulasyon ng Nan-Iav function na umaasa sa Ca2+ at kung paano ito isinama sa mga proseso ng neuronal signaling.. 13,21
Sa pag-aaral na ito, gamit ang pinagsamang cryo-electron microscopy, electrophysiology, at mga pamamaraan ng pagbubuklod ng radioligand, nilinaw namin ang pagbubuklod ng Nan-Iav at ang mekanismo ng pagbubuklod nito sa mga regulator ng maliliit na molekula. Bukod pa rito, natukoy namin ang constitutively bounded calmodulin (CaM) sa Iav at mga AP-stabilized Nan pentamer. Ang mga resultang ito ay nagbibigay ng mahahalagang pananaw sa regulasyon ng mga calcium ion sa mga channel, pagbubuklod ng channel, at ang mga salik na tumutukoy sa affinity ng pagbubuklod ng ligand. Higit sa lahat, nakumpirma namin na ang ARD ay gumaganap ng isang pangunahing papel sa mga prosesong ito. Ang aming pag-aaral ng kumpletong mga channel ng insekto na nakagapos sa mga kaugnay na pestisidyong pang-agrikultura27, 28, 29nagbubukas ng mga pagkakataon para sa pag-unlad ng industriya ng pestisidyo, pagpapabuti ng bisa at espesipisidad ng mga pestisidyo, at pagpapagana ng aplikasyon ng mga compound na naka-target sa TRPV sa iba pang mga uri ng hayop upang matugunan ang pandaigdigang seguridad sa pagkain at ang pagkalat ng mga sakit na dala ng vector.
Natuklasan din namin na ang Nan-Iav ay kinokontrol ng Ca2+, at ang mekanismo ng regulasyon ay namamagitan sa constitutively bound CaM. Mahalaga, ang regulasyong ito na umaasa sa Ca2+ ng Nav ng CaM ay lubhang naiiba sa mga mekanismo ng regulasyon ng iba pang mga ion channel (hal., mga voltage-gated na Na+ channel at TRPV5/6 channel)52,53,54,55,56,57Sa Nav1.2 channel, ang C-terminal domain ng CaM ay helical na nakakabit sa C-terminal domain (CTD), at ang Ca2+ ay nagdudulot ng pagbibigkis ng N-terminal domain nito sa distal na bahagi ng CTD.56Sa TRPV5/6 channel, ang C-terminal domain ng CaM ay nagbibigkis sa CTH, at ang Ca2+ ay nagdudulot ng pataas na pag-usad ng N-terminal domain nito papasok sa butas, sa gayon ay hinaharangan ang cation permeability.53,54. Nagmumungkahi kami ng isang modelo para sa Ca2+-regulated function ng Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Sa modelong ito, ang N-terminal domain ng CaM ay patuloy na nagbibigkis sa C-terminal domain (CTH) ng Iav. Sa resting state (mababang konsentrasyon ng [Ca2+]), ang C-terminal domain ng CaM ay nakikipag-ugnayan sa Nan, na nagpapatatag sa ARD conformation at sa gayon ay nagtataguyod ng pagbubukas ng channel. Ang pagbubuklod ng isang agonist/insecticide sa channel ay nagdudulot ng pagbubukas ng pore, na humahantong sa pagdagsa ng Ca2+. Pagkatapos ay nagbibigkis ang Ca2+ sa CaM, na nagiging sanhi ng paghihiwalay ng C-terminal domain mula sa ARD ng Nan. Dahil ang pagharang sa pagbubuklod ng CaM ay mahalagang nagpapawalang-bisa sa inhibitory effect ng Ca2+, ang paghihiwalay na ito ay nagmo-modulate sa ARD mobility, sa gayon ay nagiging sanhi ng Ca2+-dependent inhibition o desensitization. Ang mabilis na pagbawi ng mga channel current pagkatapos ng calcium ion elution (Fig. 4g) ay nagmumungkahi na ang mekanismong ito ay nagpapadali sa mabilis na pagtugon sa mga neuronal signal na pinamagitan ng Ca2+. Bukod pa rito, ang C-terminal na rehiyon ng Iav, na nananatiling hindi gaanong nauunawaan, ay naiulat na gumaganap ng iba pang mga papel sa pag-target sa channel at kasalukuyang regulasyon.21
Panghuli, inilalahad ng aming pag-aaral ang mataas na resolusyon na istruktura ng isang insecticide-insecticide TRP channel complex na may kahalagahan sa agrikultura—isang tuklas na dati'y hindi namin alam. Kapansin-pansin, inilarawan namin ang istruktura at tungkulin ng insect channel sa mga selula ng tao (HEK293S GnTi–) sa halip na sa mga selula ng insekto. Sa harap ng lumalaking resistensya sa insecticide at patuloy na presyon sa seguridad sa pagkain at mga pathogen, ang aming trabaho ay nagbibigay ng mahalagang impormasyon na magpapadali sa pagbuo ng mga bagong insecticide para sa kapakinabangan ng kalusugan ng tao at pandaigdigang seguridad sa pagkain. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang mga insecticide tulad ng AP ay epektibo laban sa ilang mga peste kapag ginamit ayon sa mga tagubilin sa label at may mababang talamak na toxicity sa mga kapaki-pakinabang na pollinator, na nagpapakita ng kanilang kaligtasan sa kapaligiran.13,16Bukod pa rito, ipinakita ng pagsusuri sa ilang AP derivatives sa mga lamok na kalaunan ay nawawalan sila ng kakayahang lumipad. Ang pag-unawa kung paano nagbibigkis ang mga modulating compound na ito sa Nan-Iav ay magpapadali sa pagbabago ng mga umiiral na compound o pagbuo ng mga bagong compound para sa mas epektibo attumpakpagkontrol ng peste. Ipinapakita ng aming pag-aaral na ang Nan-Iav ARD interface ay kritikal hindi lamang para sa pag-regulate ng aktibidad ng mga endogenous compound, pestisidyo, at Ca2+-CaM, kundi pati na rin para sa channel assembly. Iminumungkahi namin na ang paggambala sa heterodimer assembly gamit ang maliliit na molekula ay maaaring isang kakaiba at promising na pamamaraan para sa pagbuo ng mga ion channel inhibitor.
Sa walong orthologous genes, ang mga full-length genes ng brown beetle (Halyomorpha halys) na Nanchung at Inactive ang napili, na nagpapakita ng mahusay na estabilidad sa mga detergent. Ang mga na-synthesize na genes ay na-codon-optimize para sa ekspresyon ng tao at na-clone sa pBacMam pCMV-DEST vector (Life Technologies) gamit ang XhoI at EcoRI restriction sites. Tiniyak nito na ang mga clone ay naka-frame kasama ang C-terminal GFP-FLAG-10xHis at mCherry-FLAG-10xHis tags, na pinuputol ng HRC-3C protease (PPX), na nagpapahintulot sa mga independiyentengpagpapahayagAng mga primer na ginamit upang i-clone ang Nanchung at Inactive sa pBacMam vector ay ang mga sumusunod:
Ang mga mikroskopikong imahe ng mga indibidwal na partikulo ay nakuha gamit ang isang Titan Krios G2 transmission electron microscope (FEI) na nilagyan ng K3 camera at isang Gatan BioQuantum energy filter. Ang mikroskopyo ay pinaandar sa 300 keV, na may setting ng enerhiya na 20 eV, laki ng sample pixel na 1.08 Å/pixel (nominal magnification na 81,000x), at isang defocus gradient na mula -0.8 hanggang -2.2 μm. Ang pag-record ng video ay isinagawa sa 40 frames per second gamit ang isang Latitude S microscope (Gatan) na may nominal dose rate na 25 e–px−1 s−1, oras ng pagkakalantad na 2.4 s, at kabuuang dosis na humigit-kumulang 60 e–Å−2.
Isinagawa ang beam-induced motion correction at dose weighting sa film gamit ang MotionCor2 sa RELION 4.061. Isinagawa ang contrast transfer function (CTF) parameter estimation sa cryoSPARC gamit ang patch-based CTF estimation method62. Ang mga photomicrograph na may CTF fitting resolution na ≥4 Å ay hindi isinama sa kasunod na pagsusuri. Kadalasan, isang subset ng 500–1000 photomicrograph ang ginamit para sa pagpili ng punto sa cryoSPARC, na sinundan ng ilang round ng 2D classification pagkatapos ng filtering upang makakuha ng malinaw na reference image para sa template-based particle selection. Pagkatapos ay kinuha ang mga particle gamit ang 64-pixel bounding boxes at 4-fold binning. Ilang round ng 2D classification ang isinagawa upang alisin ang mga hindi gustong kategorya ng particle. Ang unang 3D model ay muling binuo gamit ang ab initio reconstruction at pino gamit ang nonuniform refinement sa cryoSPARC. Isinagawa ang 3D classification sa cryoSPARC o RELION batay sa ARD heterogeneity. Walang naobserbahang makabuluhang heterogeneity ng mga membrane domain. Pinino ang mga partikulo gamit ang mga pamamaraang C1 at C2; ang mga partikulo na may mas mataas na resolusyon ng C2 ay itinuring na simetriko kaugnay ng C2 at ini-import sa RELION para sa Bayesian refinement. Ang mga partikulo ay inilipat pabalik sa cryoSPARC para sa pangwakas na hindi pare-pareho at lokal na refinement. Ang pangwakas na resolusyon at bilang ng mga partikulo ay ipinapakita sa Talahanayan 1.
Nang pinoproseso ang mga Nan+AP pentamer, sinuri namin ang iba't ibang pamamaraan para mapabuti ang resolution ng mga membrane domain (lalo na ang pore region), tulad ng signal subtraction at TMD masking. Gayunpaman, ang mga pagtatangkang ito ay hindi naging matagumpay dahil sa potensyal na matinding disorder sa pore region at sa pangkalahatang heterogeneity ng TMD. Ang pangwakas na resolution ay kinalkula gamit ang isang mask na awtomatikong nabuo ng nonuniform processing method sa cryoSPARC, na pangunahing nagta-target sa ARD region. Nakamit nito ang mas mataas na resolution kaysa sa mga membrane domain (lalo na ang VSLD region).
Ang mga paunang de novo na modelo ng mga apo form ng Nanchung at Inactive bugs ay unang nabuo gamit ang Coot63, at ang mga modelo ng Nan at Iav bugs ay nabuo gamit ang AlphaFold264 upang matukoy ang mga low-confidence na rehiyon. Ang pagmomodelo ng Calmodulin ay batay sa rigid-body fit ng mga modelong Ca2+-binding at Ca2+-free sa mga accession ng PDB na 4JPZ56 at 1CFD65, ayon sa pagkakabanggit. Pinuhin ang mga modelo gamit ang spherical refinement upang matiyak ang tamang stereochemistry at mahusay na geometry. Ang Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, at phosphatidylserine ay minelode bilang mahusay na natukoy na mga lipid densities, at ang mga NAM at AP ligands ay inilagay sa kaukulang mga densidad sa mga tight junction. Ang mga constraint file ay nabuo mula sa SMILES string ng mga isoform gamit ang eLBOW sa PHENIX66. Panghuli, ang mga modelo ay pino sa totoong espasyo sa PHENIX gamit ang local grid search at global minimization na may mga secondary structure constraint. Ginamit ang MolProbity server para sa pagpipino ng modelo at pagsusuri ng istruktura, at ang mga ilustrasyon ay isinagawa gamit ang PyMOL at UCSF Chimera X. 67,68,69 Ang pagsusuri ng aperture ay isinagawa gamit ang HOLE server,70 at ang pagmamapa ng konserbasyon ng sequence ay isinagawa gamit ang Consurf server.71
Isinagawa ang pagsusuring istatistikal gamit ang Igor Pro 6.2, Excel Office 365, at GraphPad Prism 7.0. Ang lahat ng kwantitatibong datos ay ipinakita bilang mean ± standard error (SEM). Ginamit ang Student's t-test (two-tailed, unpaired) upang paghambingin ang dalawang grupo. Ang One-way analysis of variance (ANOVA) na sinundan ng Dunnett's post hoc test ay ginamit upang paghambingin ang maraming grupo. *P< 0.05, **P< 0.01, at ***PAng < 0.001 ay itinuring na makabuluhan sa istatistika depende sa distribusyon ng datos. Ang mga halaga ng Kd, Ki, at ang kanilang asymmetric 95% confidence intervals ay kinalkula gamit ang GraphPad Prism 10.
Para sa karagdagang detalye sa metodolohiya ng pag-aaral, pakitingnan ang Buod ng Ulat sa Portfolio ng Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.
Ang unang modelo ay binuo gamit ang mga modelong calmodulin mula sa mga database ng PDB 4JPZ at 1CFD. Ang mga coordinate ay idineposito sa Protein Data Bank (PDB) sa ilalim ng mga accession number na 9NVN (Nan-Iav-CaM na walang ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM na nakatali sa nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM na nakatali sa nicotinamide at EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM na nakatali sa aphenidolpyrrolline at calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM na nakatali sa aphenidolpyrrolline at EDTA), at 9NVS (Nan pentamer na nakatali sa aphenidolpyrrolline). Ang mga katumbas na imahe ng cryo-electron microscopy ay idineposito sa Electron Microscopy Database (EMDB) sa ilalim ng mga sumusunod na accession number: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM na walang ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM complex na may nicotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM complex na may nicotinamide at EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM complex na may aphidopyrrolline at calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM complex na may aphidopyrrolline at EDTA), at EMD-49849 (Nan pentamer complex na may aphidopyrrolline). Ang hilaw na datos para sa functional analysis ay inilalahad sa papel na ito.
Oras ng pag-post: Enero 28, 2026