Mga materyales ng halaman at pathogen
Isang populasyon ng sorghum association mapping na kilala bilang sorghum conversion population (SCP) ang ibinigay ni Dr. Pat Brown sa University of Illinois (ngayon ay nasa UC Davis). Ito ay nailarawan na noon at isang koleksyon ng magkakaibang linya na na-convert sa photoperiod-insensitivity at mas maliit na tangkad upang mapadali ang paglaki at pag-unlad ng mga halaman sa mga kapaligiran ng US. 510 linya mula sa populasyon na ito ang ginamit sa pag-aaral na ito bagaman dahil sa mahinang pagtubo at iba pang mga isyu sa pagkontrol ng kalidad, hindi lahat ng linya ay ginamit sa pagsusuri ng lahat ng tatlong katangian. Sa huli, ang datos mula sa 345 linya ang ginamit para sa pagsusuri ng tugon ng chitin, 472 linya para sa tugon ng flg22, at 456 para sa resistensya ng TLS.B. cookeiAng strain na LSLP18 ay nakuha mula kay Dr. Burt Bluhm sa University of Arkansas.
Pagsukat ng tugon ng MAMP
Dalawang magkaibang MAMP ang ginamit sa pag-aaral na ito flg22, (Genscript catalog# RP19986), at chitin. Ang mga halamang sorghum ay itinanim sa mga insert na inilatag sa mga patag na puno ng lupa (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) sa greenhouse. Ang mga halaman ay dinidiligan isang araw bago ang pagkolekta ng sample upang maiwasan ang labis na kahalumigmigan ng dahon sa araw ng pagkolekta.
Ang mga linya ay randomized at, para sa mga kadahilanang logistikal, ay itinanim sa mga batch na may 60 linya. Para sa bawat linya, tatlong 'paso' ang itinanim na may dalawang buto bawat linya. Ang mga kasunod na batch ay itinanim sa sandaling maproseso ang nakaraang batch hanggang sa masuri ang buong populasyon. Dalawang eksperimento ang isinagawa para sa parehong MAMP kung saan ang mga genotype ay muling randomized sa bawat isa sa dalawang pagtakbo.
Isinagawa ang mga ROS assay gaya ng nailarawan noon. Sa madaling salita, para sa bawat linya, anim na buto ang itinanim sa 3 magkakaibang paso. Mula sa mga nagresultang punla, tatlo ang pinili batay sa pagkakapareho. Ang mga punla na mukhang kakaiba o mas matangkad o mas maikli kaysa sa karamihan ay hindi ginamit. Apat na leaf disc na may 3 mm na diyametro ang tinanggal mula sa pinakamalawak na bahagi ng ika-4 na dahon ng tatlong magkakaibang 15-araw na gulang na halaman ng sorghum. Isang disc bawat dahon mula sa dalawang halaman at dalawang disc mula sa isang halaman, kung saan ang pangalawang disc ang magiging kontrol ng tubig (tingnan sa ibaba). Ang mga disc ay isa-isang pinalutang sa 50 µl H20 sa isang itim na 96-well plate, tinatakan ng aluminum seal upang maiwasan ang pagkakalantad sa liwanag, at pinanatili sa temperatura ng silid magdamag. Kinabukasan, isang solusyon ng reaksyon ang ginawa gamit ang 2 mg/ml chemiluminescent probe L-012 (Wako, catalog # 120-04891), 2 mg/ml horseradish peroxidase (Type VI-A, Sigma-Aldrich, catalog # P6782), at 100 mg/ml Chitin o 2 μM ng Flg22. 50 µl ng solusyon ng reaksyon na ito ang idinagdag sa tatlo sa apat na balon. Ang pang-apat na balon ay isang mock control, kung saan idinagdag ang solusyon ng reaksyon na hindi kasama ang MAMP. Apat na blankong balon na naglalaman lamang ng tubig ang isinama rin sa bawat plato.
Matapos idagdag ang reaction solution, ang luminescence ay sinukat gamit ang SynergyTM 2 multi-detection microplate reader (BioTek) bawat 2 minuto sa loob ng 1 oras. Ang plate reader ay kumukuha ng mga sukat ng luminescence bawat 2 minuto sa loob ng 1 oras na ito. Ang kabuuan ng lahat ng 31 na pagbasa ay kinalkula upang mabigyan ang halaga para sa bawat balon. Ang tinantyang halaga para sa tugon ng MAMP para sa bawat genotype ay kinalkula bilang (average na halaga ng luminescence ng tatlong experimental well—ang halaga ng mock well) -bawas ang average na halaga ng blank well. Ang mga halaga ng blank well ay palaging malapit sa zero.
Mga disc ng dahonNicotiana benthamiana, isang linya ng sorghum na may mataas na tugon (SC0003), at isang linya ng sorghum na may mababang tugon (PI 6069) ay isinama rin bilang mga kontrol sa bawat 96-well plate para sa mga layunin ng pagkontrol sa kalidad.
B. cookeipaghahanda at pagbabakuna ng inokulum
B. cookeiAng inoculum ay inihanda gaya ng nailarawan noon. Sa madaling salita, ang mga butil ng sorghum ay ibinabad sa tubig sa loob ng tatlong araw, hinugasan, isinalok sa 1L na conical flasks at ini-autoclave sa loob ng isang oras sa 15psi at 121 °C. Ang mga butil ay pagkatapos ay inoculate ng humigit-kumulang 5 ml ng macerated mycelia mula sa isang sariwang kultura ngB. cookeiAng LSLP18 ay naghihiwalay at iniwan sa loob ng 2 linggo sa temperatura ng silid, inalog ang mga prasko kada 3 araw. Pagkatapos ng 2 linggo, ang mga butil ng sorghum na pinasapian ng fungus ay pinatuyo sa hangin at pagkatapos ay iniimbak sa 4 °C hanggang sa pagbabakuna sa bukid. Ang parehong inoculum ay ginamit para sa buong pagsubok at ginawang sariwa bawat taon. Para sa pagbabakuna, 6-10 butil na pinasapian ng fungus ang inilagay sa mga halamang sorghum na may edad na 4-5 linggo. Ang mga spore na nalikha mula sa mga fungi na ito ang nagpasimula ng impeksyon sa mga batang halamang sorghum sa loob ng isang linggo.
Paghahanda ng binhi
Bago itanim sa bukid, ang buto ng sorghum ay nilagyan ng fungicide, insecticide, at pinaghalong safener na naglalaman ng humigit-kumulang 1% Spirato 480 FS fungicide, 4% Sebring 480 FS fungicide, at 3% Sorpro 940 ES seed safener. Pagkatapos, ang mga buto ay pinatuyo sa hangin sa loob ng 3 araw na nagbigay ng manipis na patong ng pinaghalong ito sa paligid ng mga buto. Dahil sa safener, nagamit ang herbicide na Dual Magnum bilang pre-emergence treatment.
Pagsusuri ng resistensya sa Target na Leaf Spot
Ang SCP ay itinanim sa Central Crops Research Station sa Clayton, NC noong Hunyo 14–15, 2017 at Hunyo 20, 2018 sa isang randomized complete block design na may dalawang experimental replications sa bawat kaso. Ang mga eksperimento ay itinanim sa 1.8 m na single rows na may 0.9 m na row width gamit ang 10 seeds bawat plot. Dalawang border rows ang itinanim sa paligid ng bawat eksperimento upang maiwasan ang mga edge effects. Ang mga eksperimento ay inoculated noong Hulyo 20, 2017 at Hulyo 20, 2018 kung saan ang mga halamang sorghum ay nasa growth stage 3. Ang mga rating ay kinuha sa isa hanggang siyam na iskala, kung saan ang mga halamang walang senyales ng sakit ay binigyan ng marka bilang siyam at ang mga ganap na patay na halaman ay binigyan ng marka bilang isa. Dalawang rating ang kinuha noong 2017 at apat na readings noong 2018 simula dalawang linggo pagkatapos ng inoculation bawat taon. Ang sAUDPC (standardized area under disease progression curve) ay kinalkula gaya ng nailarawan dati.
Oras ng pag-post: Abr-01-2021