Mga materyales sa halaman at pathogen
Isang populasyon ng pagmamapa ng asosasyon ng sorghum na kilala bilang populasyon ng sorghum conversion (SCP) ay ibinigay ni Dr. Pat Brown sa Unibersidad ng Illinois (ngayon ay nasa UC Davis).Ito ay inilarawan dati at isang koleksyon ng magkakaibang mga linya na na-convert sa photoperiod-insensitivity at mas maliit na tangkad upang mapadali ang paglaki at pag-unlad ng mga halaman sa mga kapaligiran ng US.510 linya mula sa populasyon na ito ang ginamit sa pag-aaral na ito bagaman dahil sa masamang pagtubo at iba pang mga isyu sa pagkontrol sa kalidad, hindi lahat ng linya ay ginamit sa pagsusuri ng lahat ng tatlong katangian.Sa huli, ginamit ang data mula sa 345 na linya para sa pagsusuri ng tugon ng chitin, 472 na linya para sa tugon ng flg22, at 456 para sa paglaban sa TLS.B. cookeiang strain LSLP18 ay nakuha mula kay Dr. Burt Bluhm sa Unibersidad ng Arkansas.
Pagsukat ng tugon ng MAMP
Dalawang magkaibang MAMP ang ginamit sa pag-aaral na ito flg22, (Genscript catalog# RP19986), at chitin .Ang mga halaman ng sorghum ay pinatubo sa mga insert na inilatag sa mga flat na puno ng lupa (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) sa greenhouse.Ang mga halaman ay dinidiligan isang araw bago ang koleksyon ng sample upang maiwasan ang labis na kahalumigmigan ng dahon sa araw ng koleksyon.
Ang mga linya ay randomized at, para sa logistical na mga kadahilanan, ay nakatanim sa mga batch ng 60 mga linya.Para sa bawat linya, tatlong 'paso' ang itinanim na may dalawang buto bawat linya.Ang mga kasunod na batch ay itinanim sa sandaling maproseso ang nakaraang batch hanggang sa masuri ang buong populasyon.Dalawang pang-eksperimentong pagtakbo ang isinagawa para sa parehong mga MAMP na may mga genotype na muling na-random sa bawat isa sa dalawang pagtakbo.
Ang mga assay ng ROS ay isinagawa tulad ng inilarawan dati.Sa madaling sabi, para sa bawat linya, anim na buto ang itinanim sa 3 magkakaibang paso.Mula sa mga nagresultang punla, tatlo ang napili batay sa pagkakapareho.Hindi ginamit ang mga punla na mukhang kakaiba o mas mataas o mas maikli kaysa sa karamihan.Apat na leaf disc na may diameter na 3 mm ay inalis mula sa pinakamalawak na bahagi ng ika-4 na dahon ng tatlong magkakaibang 15-araw na halaman ng sorghum.Isang disc bawat dahon mula sa dalawang halaman at dalawang disc mula sa isang halaman, na ang pangalawang disc ay nagiging water control (tingnan sa ibaba).Ang mga disc ay isa-isang pinalutang sa 50 µl H20 sa isang itim na 96-well plate, tinatakan ng isang aluminum seal upang maiwasan ang pagkakalantad sa liwanag, at pinananatili sa temperatura ng silid sa magdamag.Kinaumagahan, ginawa ang reaksyong solusyon gamit ang 2 mg/ml chemiluminescent probe L-012 (Wako, catalog # 120-04891), 2 mg/ml malunggay peroxidase (Uri VI-A, Sigma-Aldrich, catalog # P6782), at 100 mg/ml Chitin o 2 μM ng Flg22.50 µl ng reaksyong solusyon na ito ay idinagdag sa tatlo sa apat na balon.Ang ikaapat na balon ay isang kunwaring kontrol, kung saan idinagdag ang solusyon sa reaksyon na hindi kasama ang MAMP.Apat na balon na walang laman na tubig lamang ang kasama sa bawat plato.
Pagkatapos idagdag ang solusyon sa reaksyon, sinusukat ang luminescence gamit ang SynergyTM 2 multi-detection microplate reader (BioTek) bawat 2 min sa loob ng 1 oras.Ang plate reader ay kumukuha ng mga sukat ng luminescence bawat 2 min sa loob ng 1 oras na ito.Ang kabuuan ng lahat ng 31 na pagbabasa ay kinakalkula upang ibigay ang halaga para sa bawat balon.Ang tinantyang halaga para sa tugon ng MAMP para sa bawat genotype ay kinakalkula bilang (average na luminescence value ng tatlong eksperimental na balon—ang mock well value) -binawasan ang average na blank well value.Ang mga halaga ng blangko na balon ay pare-parehong malapit sa zero.
Mga dahon ng disc ngNicotiana benthamiana, isang mataas na tumutugon na linya ng sorghum (SC0003), at isang mababang tumutugon na linya ng sorghum (PI 6069) ay isinama din bilang mga kontrol sa bawat 96-well plate para sa mga layunin ng kontrol sa kalidad.
B. cookeipaghahanda at pagbabakuna ng inoculum
B. cookeiAng inoculum ay inihanda tulad ng inilarawan dati.Sa madaling sabi, ang mga butil ng sorghum ay ibinabad sa tubig sa loob ng tatlong araw, binanlawan, sinalok sa 1L conical flasks at na-autoclave ng isang oras sa 15psi at 121 °C.Ang mga butil ay pagkatapos ay inoculated na may tungkol sa 5 ml ng macerated mycelia mula sa isang sariwang kultura ngB. cookeiAng LSLP18 ay humihiwalay at umalis sa loob ng 2 linggo sa temperatura ng silid, nanginginig ang mga flasks tuwing 3 araw.Pagkatapos ng 2 linggo, ang mga butil ng sorghum na infested ng fungus ay pinatuyo sa hangin at pagkatapos ay iniimbak sa 4 °C hanggang sa field inoculation.Ang parehong inoculum ay ginamit para sa buong pagsubok at ginawang sariwa bawat taon.Para sa inoculation, 6-10 infested na butil ay inilagay sa whorl ng 4-5 na linggong gulang na halaman ng sorghum.Ang mga spores na ginawa mula sa mga fungi na ito ay nagsimula ng impeksyon sa mga batang halaman ng sorghum sa loob ng isang linggo.
Paghahanda ng binhi
Bago itanim sa bukid ang buto ng sorghum ay ginagamot ng fungicide, insecticide, at safener mixture na naglalaman ng ~ 1% Spirato 480 FS fungicide, 4% Sebring 480 FS fungicide, 3% Sorpro 940 ES seed safener.Pagkatapos ang mga buto ay pinatuyo sa hangin sa loob ng 3 araw na nagbigay ng manipis na patong ng halo na ito sa paligid ng mga buto.Pinahintulutan ng safener ang paggamit ng herbicide na Dual Magnum bilang isang pre-emergence treatment.
Pagsusuri ng Target na Leaf Spot resistance
Ang SCP ay itinanim sa Central Crops Research Station sa Clayton, NC noong Hunyo 14–15 2017 at Hunyo 20, 2018 sa isang randomized na kumpletong disenyo ng bloke na may dalawang pang-eksperimentong pagtitiklop sa bawat kaso.Ang mga eksperimento ay itinanim sa 1.8 m na solong hilera na may lapad na 0.9 m hilera gamit ang 10 buto sa bawat plot.Dalawang hilera ng hangganan ang itinanim sa paligid ng paligid ng bawat eksperimento upang maiwasan ang mga epekto sa gilid.Ang mga eksperimento ay inoculated noong Hulyo 20, 2017 at Hulyo 20, 2018 kung saan ang mga halaman ng sorghum ay nasa yugto 3 ng paglago. Ang mga rating ay kinuha sa isa hanggang siyam na kaliskis , kung saan ang mga halaman na walang palatandaan ng sakit ay namarkahan bilang siyam at ganap na ang mga patay na halaman ay naitala bilang isa.Dalawang rating ang kinuha noong 2017 at apat na pagbabasa noong 2018 simula dalawang linggo pagkatapos ng inoculation bawat taon.Ang sAUDPC (standardized na lugar sa ilalim ng curve ng pag-unlad ng sakit) ay kinakalkula tulad ng inilarawan dati.
Oras ng post: Abr-01-2021